多孢木霉HZ-31菌株對(duì)藜的生理生化特性的影響

藺澤榮，朱海霞

(青海省農(nóng)林科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

藜(Chenopodiumalbum)為一年生草本植物，廣泛分布于田間，生長(zhǎng)速度快，生命力頑強(qiáng)，種子數(shù)量大，與作物爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且是某些土壤害蟲(chóng)的寄主[1-2]，是危害作物正常生長(zhǎng)的主要雜草之一.

從自然感病的大刺兒菜中分離得到的菌株HZ-31發(fā)酵液對(duì)闊葉雜草有較好的除草效果[20].木霉屬真菌種類(lèi)眾多、分布廣泛，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，由于其具有顯著的生物防治效果和重要的生物應(yīng)用價(jià)值,被公認(rèn)為是一種可取代化學(xué)藥品的農(nóng)作物保護(hù)劑.楊榕等[4]的研究結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉MF-2對(duì)黃瓜幼苗有促生作用.王騰等[5]的研究結(jié)果表明，板栗外生菌根真菌螺旋木霉和鉤狀木霉有拮抗13種以上病原菌的作用，具有廣譜性，可選為生物菌劑的潛力菌種.木霉次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性是其有效生物防治潛力的來(lái)源[6-7].本試驗(yàn)中多孢木霉HZ-31作為大刺兒菜的病原真菌，應(yīng)用于田間雜草有廣譜的除草作用，具有生防除草的潛力[8-9].

在植物代謝過(guò)程中，葉綠體、線粒體和質(zhì)膜上的電子傳遞都可能產(chǎn)生活性氧(ROS)，如超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH·)、過(guò)氧化氫(H2O2)等[10-20].植物受到寒冷、干旱、鹽害和病原物侵染等危害時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生活性氧，但是過(guò)量或者缺乏活性氧含量都會(huì)影響植物的生理變化，而病原物侵入植物的反應(yīng)是以酶含量的變化或中間產(chǎn)物的介入來(lái)實(shí)現(xiàn)的.El Alaoui-Talibi等[12,21]研究表明，多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)是重要的抗性催化合成酶，不僅可加速酚類(lèi)化合物質(zhì)量的氧化，而且參與植物的抗病性.在植物正常生命活動(dòng)代謝中，植物體內(nèi)的防御酶類(lèi)系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生清除活性氧的酶類(lèi)，避免由活性氧的積累破壞植物膜系統(tǒng)而影響植物正常生長(zhǎng)[11].

本研究以青海省常見(jiàn)的田間雜草藜作為研究對(duì)象，菌株HZ-31作為致病因子，探究病原物在對(duì)寄主的致病過(guò)程中寄主植物體內(nèi)的生理酶和蛋白酶的變化，借此來(lái)探索除草機(jī)理.通過(guò)測(cè)定防御蛋白酶POD、過(guò)氧化氫酶(CAT)、PPO、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)變化，探究接種病原物后植物體內(nèi)產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)和氧化物對(duì)病原物的抵抗或抑制作用；通過(guò)測(cè)定葉綠素含量和可溶性糖含量的變化來(lái)觀察植物受病原物刺激后表現(xiàn)出的抗性和生長(zhǎng)現(xiàn)象；通過(guò)測(cè)定丙二醛(MDA)含量變化來(lái)反應(yīng)植物受病原物入侵后其細(xì)胞膜的受損情況.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

多孢木霉HZ-31由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室，從自然感病的大刺兒菜上分離得到，并保存于該實(shí)驗(yàn)室[5].

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HZ-31發(fā)酵液制備 將實(shí)驗(yàn)室保存的多孢木霉HZ-31接種于PDA培養(yǎng)基中活化，25 ℃條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，用打孔器(Φ=8 mm)打菌餅接于PDB中，每250 mL三角瓶接5個(gè)菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3次，在25 ℃的搖床中晝夜交替培養(yǎng)7 d，待用.

1.2.2 HZ-31發(fā)酵液接種藜試驗(yàn) 將青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)地(E 101.74°，N 36.56°)田間生長(zhǎng)6～12葉期，葉色正常的藜(灰藜)幼苗移栽于直徑15 cm花盆中，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)一周.將HZ-31發(fā)酵液稀釋成濃度為1.0×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，加入適量0.05%吐溫-20作為潤(rùn)濕劑，噴霧接種到移栽的健康藜植株上，接種量為30 mL/盆.接種后于100%的相對(duì)濕度下保持24 h，隨后自然培養(yǎng)，接種無(wú)菌PDB的植株作為空白對(duì)照.分別在接種后1～7 d取樣，隨機(jī)挑選兩株，每株采取3片葉片，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于-80 ℃冰箱冷凍.

1.2.3 HZ-31菌株對(duì)藜植株生理機(jī)制的影響 按照酶活試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))步驟，進(jìn)行HZ-31菌株接種藜后植株體內(nèi)丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活力、多酚氧化酶(PPO)活力、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力、可溶性糖含量和葉綠素含量的測(cè)定.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 多孢木霉HZ-31菌株侵染對(duì)藜生長(zhǎng)的影響

多孢木霉HZ-31菌株侵染對(duì)藜生長(zhǎng)具有顯著的影響，接種HZ-31菌株3 d后，藜植株出現(xiàn)輕度萎蔫(圖1-A)；接種5 d后，萎蔫程度加重，葉片侵染部位失綠變白(圖1-B)，7 d后受侵染植株葉片失綠變白程度加重(圖1-C).

2.2 藜的生理機(jī)制變化

2.2.1 丙二醛(MDA)含量的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對(duì)照組藜MDA含量呈“M”型變化，最大為1.74 nmol/mg；處理組MDA含量先上升至最大4.62 nmol/mg，1～4 d內(nèi)處理組藜MDA含量高于對(duì)照組然后開(kāi)始下降，最大增幅67.91%.

2.2.2 過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對(duì)照組藜CAT活力呈“升-降-升-降-升-降-升”的變化趨勢(shì)，最高達(dá)6.23 U/mg；處理組藜CAT活力第1天開(kāi)始緩慢上升，至最大5.70 U/mg，比對(duì)照增加81.88%；第5天開(kāi)始呈“V”型變化趨勢(shì)，前4 a內(nèi)處理組藜CAT活力低于對(duì)照組，4天后處理組藜CAT活力顯著高于對(duì)照組.

A：藜接種3 d后的生長(zhǎng)狀況；B：藜接種5 d后的生長(zhǎng)狀況；C：藜接種7 d后的生長(zhǎng)狀況.A：Growth status of Chenopodium album at 3 days after inoculation；B：Growth status of Chenopodium album at 5 days after inoculation；C：Growth status of Chenopodium album at 7 days after inoculation.圖1 藜接種HZ-31發(fā)酵液后的生長(zhǎng)狀況Figure 1 Growth status of Chenopodium album inoculated with HZ-31 fermentation broth

圖2 多孢木霉HZ-31處理后藜的丙二醛含量變化Figure 2 Changes of malondialdehyde content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.3 過(guò)氧化物酶(POD)活力的變化 多孢木霉HZ-31侵染藜后，對(duì)照組和處理組藜POD活力處于平穩(wěn)變化狀態(tài)，且處理組始終高于對(duì)照組，最大增加46.44%，第7天后開(kāi)始下降.

圖3 多孢木霉HZ-31處理后藜的過(guò)氧化氫酶活力的變化Figure 3 Changes of catalase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

圖4 多孢木霉HZ-31處理后藜的過(guò)氧化物酶活力變化Figure 4 Changes of peroxidase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的變化 圖5顯示，接種菌株HZ-31后，對(duì)照組藜PPO活力呈“N”型變化趨勢(shì)，第3天達(dá)到最大峰值，為2.61 U/g；處理組藜PPO活力變化趨勢(shì)和對(duì)照組相似，比對(duì)照顯著增加，迅速達(dá)到酶活性峰值，為2.78 U/g，第3天開(kāi)始緩慢下降，第6天后又呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，處理組始終高于對(duì)照組，最大增幅37.68%.

圖5 多孢木霉HZ-31處理后藜的多酚氧化酶活力的變化Figure 5 Changes of polyphenol oxidase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的變化 圖6顯示，接種菌株HZ-31后，對(duì)照組和處理組藜PAL活力在1～3 d內(nèi)變化平穩(wěn)，且變化趨勢(shì)相似，從第1天開(kāi)始處理組藜的PAL活力高于對(duì)照組，第4天達(dá)到最大值72.21 U/g，且處理組PAL活力顯著增加，最大增幅為78.62%.

2.2.6 可溶性糖含量的變化 圖7顯示，藜接種菌株HZ-31后，對(duì)照組藜的可溶性糖含量呈“倒N”型變化，第5天達(dá)到峰值，為21.74 mg/g；處理組藜可溶性糖含量呈上升趨勢(shì)，第4天達(dá)到峰值，為26.30 mg/g，第4天后開(kāi)始下降；處理組始終高于對(duì)照組，最大增幅為69.37%.

圖6 多孢木霉HZ-31處理后藜的苯丙氨酸解氨酶活力變化Figure 6 Changes of phenylalanine ammonia lyase activity of Chenopodium album after Trichoderma Polysporum HZ-31 Treatment

圖7 多孢木霉HZ-31處理后藜的可溶性糖含量的變化Figure 7 Changes of soluble sugar content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

2.2.7 葉綠素含量的變化 圖8顯示，藜接種菌株HZ-31后，對(duì)照組藜葉綠素含量變化幅度大，第4天達(dá)到峰值，為6.98 mg/g.處理組藜葉綠素含量變化較平穩(wěn)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，3～6 d內(nèi)處理組葉綠素含量低于對(duì)照組，最大降幅68.04%.

2.2.8 超氧化物歧化酶(SOD)活力的變化 圖9顯示，多孢木霉HZ-31侵染藜后，第3天開(kāi)始對(duì)照組和處理組藜SOD活力均呈“W”型變化，處理組在第3天達(dá)到峰值，為220.86 U/mg，且處理組SOD活力高于對(duì)照組，最大增加8.12%.藜受菌株HZ-31刺激后SOD迅速增強(qiáng)，保護(hù)酶濃度升高，第6天后對(duì)照組與處理組均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且對(duì)照組變化快于處理組.

圖8 多孢木霉HZ-31處理后藜的葉綠素含量變化Figure 8 Changes of chlorophyll content of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

圖9 多孢木霉HZ-31處理后藜的超氧化物歧化酶活力變化Figure 9 Changes of superoxide dismutase activity of Chenopodium album after Trichoderma polysporum HZ-31 treatment

3 討論與結(jié)論

接種HZ-31菌株后，迫使藜體內(nèi)的生理系統(tǒng)發(fā)生變化，隨著接種時(shí)間的增長(zhǎng)，變化趨勢(shì)顯著.各處理的MDA含量和PPO活性均顯著高于對(duì)照，且最大分別提高了67.91%和37.68%，說(shuō)明防御系統(tǒng)產(chǎn)生抗性機(jī)制抵御外界刺激的傷害；葉綠素第3天后低于對(duì)照，說(shuō)明藜被侵染后逐漸失綠而不能正常生長(zhǎng)；PAL呈先升高后下降的變化，且始終高于對(duì)照，表明藜始終受體內(nèi)PAL的保護(hù)，濃度越高效果越好.藜的細(xì)胞組織被破壞，葉片逐漸黃化，最終枯萎死亡.本研究中MDA 含量受刺激后逐漸降低，這與趙戴軍等[19]的研究結(jié)果相符合.SOD主要是與POD和CAT等協(xié)同作用的,由CAT通過(guò)乙醛酸循環(huán)體、線粒體和過(guò)氧化物酶體將H2O2進(jìn)一步氧化成H2O和O2,清除病原物侵染植物后所產(chǎn)生的活性氧.本研究中，各處理CAT活力顯著高于對(duì)照，這與李培玲等[15]的研究結(jié)果一致.POD含量平穩(wěn)變化且始終高于對(duì)照，而SOD呈“W”變化且顯著高于對(duì)照，這與陸建英等[16]研究結(jié)果一致，刺激能增加POD酶和SOD酶的含量.本研究中，藜葉片受HZ-31菌株刺激后，PPO酶的活性呈現(xiàn)先增加后降低，然后再增加的變化趨勢(shì)，這與張藝萍等[22]研究中報(bào)道的防御酶活性提高，增強(qiáng)了植物抵抗逆境的能力的論點(diǎn)略有差異，可能與取樣的時(shí)間和地點(diǎn)有一定的關(guān)系.藜可溶性糖含量呈先增加后降低再增加的變化趨勢(shì)，但處理始終高于對(duì)照，這與李張等[18]的研究結(jié)果相反，這可能是因?yàn)榫旱臐舛容^高引起的差異.

多孢木霉HZ-31菌株侵染藜后，其生理機(jī)制防御酶變化如下：過(guò)氧化物酶(POD)活力、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力和可溶性糖含量一直高于對(duì)照組，分別增加46.44%、72.21%、8.12%和69.37%.隨著防御酶活性升高，防御能力也逐漸增強(qiáng).過(guò)氧化氫酶(CAT)活力、多酚氧化酶(PPO)活力和丙二醛(MDA)含量先升高后降低，說(shuō)明藜受菌株HZ-31侵染后防御酶被激活，增強(qiáng)了對(duì)侵染的防御能力，隨著侵染程度的增強(qiáng)，防御酶活含量降低，活力減弱，細(xì)胞膜損害程度加重，植物體對(duì)外界的抵抗力減弱.葉綠素含量持續(xù)降低，說(shuō)明藜被侵染后光合作用受到抑制，導(dǎo)致葉片失綠.