GelMA復(fù)合水凝膠的制備與性能

李媛媛，溫 瑜，李 俊，李鵬飛，白天宇，張慶濤，王 穎

(太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024)

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提升，器官替換或組織再生的需求正在迅速擴(kuò)大，而供體器官的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[1]。組織工程在過(guò)去幾年里得到了更多應(yīng)用，作為制作仿生微型人體組織模型的工具，目的是提高藥物篩選的準(zhǔn)確性和促進(jìn)個(gè)性化醫(yī)學(xué)。然而，除了一些簡(jiǎn)單的器官如皮膚[2]和軟骨[3]外，制造復(fù)雜的活體組織仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。而3D生物打印技術(shù)的研究進(jìn)展，使我們離實(shí)現(xiàn)組織工程的宏偉目標(biāo)又近了一步。原則上，理想的生物墨水應(yīng)該具有適合生物打印過(guò)程的物理化學(xué)性質(zhì)，生物打印后的組織應(yīng)具有與天然生物組織相似的生物活性及力學(xué)性能，而以水凝膠為基礎(chǔ)包覆活細(xì)胞和生物活性成分的生物墨水最受歡迎[4]。為此，許多基于水凝膠的生物墨水制劑，如明膠甲基丙烯酰基亞胺，丙烯酸酯功能化聚乙二醇，海藻酸鈉，瓊脂糖和膠原蛋白已被采用，或單獨(dú)使用或組合使用。

利用明膠作為生物材料，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)方法克服了明膠在體溫下的不穩(wěn)定性[5]。GelMA是明膠和甲基丙酸酐(MA)反應(yīng)的產(chǎn)物。除此之外，MA對(duì)明膠的化學(xué)接枝率會(huì)很低，也就意味著大部分RGD基序、MMP可降解基序基本不會(huì)受到影響，這將確保GelMA保持良好的細(xì)胞黏附性能和降解性[6]。GelMA作為一種性能優(yōu)異的水凝膠，已被證實(shí)可打印成多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且細(xì)胞存活率較高[7]，也可用于組織工程的載細(xì)胞構(gòu)建體[8]。到目前為止，各種基于GelMA的生物墨水已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)，允許打印出復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)，可用于人工血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及牙周缺損修復(fù)材料。因此，GelMA將在生物打印中發(fā)揮更重要的作用，以促進(jìn)功能組織和仿生組織的生成。而通過(guò)混合GelMA與其他生物材料制備復(fù)合水凝膠來(lái)提高其性能也成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。殼聚糖CS是幾丁質(zhì)的部分去乙?；苌颷9]，由于其相當(dāng)可觀的抗菌和止血性能已經(jīng)被當(dāng)作組織工程理想的支架材料[10]。明膠與殼聚糖的混合物由于其優(yōu)異的生物學(xué)性能，被制作成各種支架應(yīng)用于組織工程的眾多領(lǐng)域，如皮膚[11]、軟骨[12]、骨[13]、神經(jīng)[14]、肝臟[15]等。

在水凝膠的使用中，物理特性(即孔隙率、彈性模量、降解和水溶脹)的表征，決定其是否適合不同組織工程應(yīng)用。本研究進(jìn)行了GelMA前體和ChelMA前體的制備；其次，制備了GelMA及其復(fù)合水凝膠(添加ChelMA、PEG(200)DA)，并對(duì)其進(jìn)行力學(xué)和物理性能檢測(cè)，并比較得出適合用于打印人工材料的復(fù)合水凝膠。通過(guò)制備不同配比的GelMA復(fù)合水凝膠，可有效改善GelMA的力學(xué)性能，使其滿足不同組織器官的機(jī)械性能，并調(diào)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)(溶脹性和孔隙率)，為今后進(jìn)一步引入生物活性細(xì)胞及應(yīng)用于不同的活體材料奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

明膠(藥用級(jí)，購(gòu)自Solarbio公司)，殼聚糖(脫乙酰度為75%～85%，中分子量，購(gòu)自Macklin公司)，甲基丙烯酸酐(純度94%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)，PEG(200)DA(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)，光引發(fā)劑Irgacure2959(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)。本研究所用的試劑和溶液均為試劑級(jí)。

1.2 GelMA和ChelMA的合成

GelMA前體合成[16-17]：將10 g明膠溶于100 mL PBS溶液中，磁力攪拌。然后將MA溶液(質(zhì)量比8%)滴加到上述混合物中，反應(yīng)2 h后，將混合溶液在去離子水中透析一周，冷凍干燥后得到GelMA前體。將5 g殼聚糖溶解在200 mL醋酸(質(zhì)量濃度3%)[18]溶液中，磁力攪拌。然后滴加8 mL MA溶液到上述混合物中，反應(yīng)2 h后，將混合溶液在去離子水中透析一周，冷凍干燥后得到CS-MA前體，本文中將此混合物簡(jiǎn)稱為ChelMA.

1.3 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的制備

稱取一定量GelMA前體，分別加入Irgacure 2959水溶液中，在紫外光照射5 min后聚合成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，15%，20%，25%的GelMA.在Irgacure 2959水溶液中加入0.9 g ChelMA前體，制備質(zhì)量濃度為3%的ChelMA溶液。將GelMA溶液和ChelMA溶液按1∶4，2∶3，1∶1，4∶1，3∶2的體積比例混合，紫外光照射5 min后得到GelMA-ChelMA水凝膠。在GelMA溶液中加入體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA溶液，紫外光照射5 min后得到GelMA-PEG(200)DA水凝膠[19]。

1.4 FTIR分析

將明膠、GelMA前體、殼聚糖和ChelMA前體凍干，利用Shimadzu FT-IR光譜儀進(jìn)行紅外測(cè)試，分辨率為2 cm-1，波數(shù)范圍為400 cm-1～4 000 cm-1.

1.5 力學(xué)性能分析

光固化后的水凝膠用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)分別進(jìn)行單向壓縮試驗(yàn)表征光交聯(lián)GelMA水凝膠，GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠，GelMA-PEG(200)DA復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能。以3 mm/min的位移速率壓縮，壓縮至原高度的40%.

1.6 SEM分析

將凍干后的GelMA、GelMA-ChelMA水凝膠和GelMA-PEG(200)DA水凝膠切片，噴金，用掃描電子顯微鏡觀察樣品表面特征。

1.7 吸水率、溶脹率及交聯(lián)率分析

取冷凍干燥的GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA水凝膠、GelMA-PEG(200)DA水凝膠稱重，記為m1.將樣品浸泡在PBS溶液中，保溫37 ℃，分別在0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 h時(shí)取出樣品，稱重記為m2.計(jì)算每個(gè)時(shí)刻下的吸水率W；之后繼續(xù)溶脹，24 h后稱重記為m3.最后再冷凍干燥，稱重記為m4，計(jì)算溶脹率S和交聯(lián)率Y[19].每組做3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

(1)

(2)

Y=(m4-m1)×100% .

(3)

1.8 孔隙率分析

取冷凍干燥的GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA水凝膠、GelMA-PEG(200)DA水凝膠在無(wú)水乙醇中浸泡，不發(fā)生溶脹行為，用乙醇置換的方法測(cè)定孔隙率[20]。方法如下：取干態(tài)水凝膠稱重，記為md，用無(wú)水乙醇浸沒樣品，用真空泵進(jìn)行抽真空，直到干態(tài)水凝膠沉底，取出稱重為ms，計(jì)算孔隙率q.

(4)

式中：ρ是乙醇在24.5 ℃時(shí)的密度(0.79 g/mL)；V是支架的體積。每組3個(gè)樣品，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的合成

紫外光下，光引發(fā)劑形成自由基，與GelMA、ChelMA上的光敏性甲基丙烯酰胺基團(tuán)的雙鍵發(fā)生反應(yīng)，使GelMA、ChelMA上帶有自由基，之后進(jìn)行自由位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，進(jìn)攻GelMA、ChelMA上游離的甲基丙烯酰胺基團(tuán)雙鍵，直至共聚反應(yīng)終止，最后形成交聯(lián)分子鏈。明膠雖然含有大量的氨基，但是進(jìn)行丙烯酰化的位點(diǎn)卻很少，所以在發(fā)生?；磻?yīng)后，分子上光敏性基團(tuán)也很少。其次，明膠屬于大分子，空間位阻較大，會(huì)降低GelMA的交聯(lián)率。所以在GelMA中添加小分子量的PEG(200)DA，空間位阻會(huì)??；除此之外，加入PEG(200)DA使反應(yīng)體系中雙鍵數(shù)量增加，交聯(lián)點(diǎn)隨之也會(huì)增加，最后生成三維網(wǎng)絡(luò)聚合物。PEG(200)DA的加入，能夠提供更多活性基團(tuán)，使水凝膠交聯(lián)度提高，解決單純GelMA光交聯(lián)存在的問(wèn)題。

從水凝膠合成圖可以看出，水凝膠呈現(xiàn)果凍狀，顏色為淡乳白色且滲透著淡黃色。如圖1(a)從左到右依次為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、15%、20%、25%的GelMA，隨著濃度的增加，水凝膠的顏色變得越來(lái)越黃。圖1(b)從左到右依次為GelMA和ChelMA體積比為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1，隨著體積比的增大，水凝膠的淺黃色逐漸變淺。圖1(c)從左到右依次為GelMA中加入體積分?jǐn)?shù)30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA，隨著PEG(200)DA的體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，水凝膠的顏色也逐漸變白。

圖1 (a) 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GelMA；(b) 不同體積比的GelMA和ChelMA；(c) 不同體積分?jǐn)?shù)的GelMA-PEG(200)DAFig.1 (a) Different concentrations of GelMA；(b) Different ratios of GelMA to ChelMA；(c) Different concentrations of GelMA-PEGDA

2.2 FTIR分析

圖2 (a) GelMA和明膠的紅外光譜；(b) ChelMA和殼聚糖的紅外光譜Fig.2 (a) FTIR spectra of GelMA and Gelatin；(b) FTIR spectra of ChelMA and CS

2.3 SEM表征結(jié)果

根據(jù)3種水凝膠的SEM圖像(如圖3所示)顯示，其表面結(jié)構(gòu)存在很大的不同。由圖3可知：GelMA水凝膠質(zhì)量濃度的增加對(duì)其孔洞大小無(wú)明顯影響。而GelMA-ChelMA的孔狀結(jié)構(gòu)幾乎全被一層膜遮蓋，并且隨著CS濃度的減小，孔洞更大，孔壁更厚，說(shuō)明更多的大分子鏈被纏繞和結(jié)合在一起。加入PEG(200)DA后，水凝膠表面孔隙結(jié)構(gòu)與另兩種材料有區(qū)別，結(jié)構(gòu)表面仍呈現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，但表面的孔比較粗糙，可能是由于材料韌性斷裂而引起。

圖3 不同水凝膠的SEM表征Fig.3 Morphology of various hydrogels

2.4 力學(xué)性能分析

圖4為GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的典型壓縮曲線和彈性模量值。圖4可見隨著GelMA質(zhì)量濃度的增加彈性模量也增加，且增加較明顯。GelMA與ChelMA體積比增大，彈性模量減小，但是減小不明顯。說(shuō)明在GelMA中添加ChelMA，可以增強(qiáng)力學(xué)性能。隨著PEG(200)DA體積分?jǐn)?shù)的增大，彈性模量顯著增大。相較于GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠，GelMA-PEG(200)DA復(fù)合水凝膠的彈性模量很大，是因?yàn)榧尤隤EG(200)DA使GelMA分子鏈之間的交聯(lián)密度增大從而起到了類似交聯(lián)劑的作用[19]，說(shuō)明PEG(200)DA的加入，可以顯著增強(qiáng)力學(xué)性能。圖4顯示，雖然加入PEG(200)DA的水凝膠彈性模量會(huì)增大，但是變得更易破壞，在應(yīng)變?yōu)?0%左右發(fā)生破壞。

圖4 三種水凝膠的機(jī)械性能Fig.4 Mechanical behaviors of three hydrogels

2.5 吸水率、溶脹率及交聯(lián)率分析結(jié)果

圖5顯示，隨著時(shí)間的增加，3種水凝膠都是在0.5 h內(nèi)吸水最快，雖然0.5 h之后吸水率仍在增大，但變化很小，慢慢趨于穩(wěn)定。GelMA質(zhì)量濃度升高，吸水率減小。GelMA與ChelMA的體積比變大，吸水能力變?nèi)?。PEG(200)DA體積分?jǐn)?shù)增大，吸水率減小。GelMA-PEG(200)DA復(fù)合水凝膠的吸水率普遍低于GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的GelMA水凝膠吸水率高于3∶2，4∶1(GelMA與ChelMA體積比)的GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠；質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，20%，25%的GelMA水凝膠吸水率均低于GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠的吸水率。

圖5 各種水凝膠的吸水率Fig.5 Water absorption of various hydrogels

表1顯示，GelMA溶液中添加ChelMA和PEG(200)DA，可以一定程度上提高水凝膠的交聯(lián)率，也可以一定程度上降低溶脹率；GelMA-PEG(200)DA復(fù)合水凝膠的溶脹率，顯著低于GelMA水凝膠和GelMA-ChelMA復(fù)合水凝膠，說(shuō)明添加PEG(200)DA后，可以改善水凝膠的溶脹性。Gel-MA質(zhì)量濃度升高，溶脹率減小，交聯(lián)率也減小，可能是由于明膠的分子量大，濃度增高使其空間位阻增大導(dǎo)致。GelMA和ChelMA體積比增大，溶脹率和交聯(lián)率都減小。ChelMA和GelMA上的紫外光引發(fā)活性中心都比較少，交聯(lián)反應(yīng)受到影響，隨之降低。PEG(200)DA體積分?jǐn)?shù)的增大，交聯(lián)率增大，溶脹率降低。PEG(200)DA中雙丙烯酸酯基團(tuán)的增加使交聯(lián)點(diǎn)增加，隨之交聯(lián)率就會(huì)增加。

表1 三種水凝膠的物理特性Table 1 Physical properties of three hydrogels %

2.6 孔隙率分析

由圖6可知，GelMA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，孔隙率減小，說(shuō)明GelMA水凝膠質(zhì)量濃度越大，形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加的緊密。GelMA與ChelMA的體積比增大，孔隙率減小，但是減小不明顯，但仍可以說(shuō)明加入ChelMA會(huì)影響GelMA水凝膠的孔隙率，會(huì)使GelMA水凝膠更加緊密。PEG(200)DA體積分?jǐn)?shù)的增大，孔隙率減小，是因?yàn)镻EG(200)DA的加入使GelMA分子之間的連接更加緊密。

圖6 各種水凝膠的孔隙率Fig.6 Poriness of various hydrogels

3 結(jié)論

綜上所述，在GelMA中加入ChelMA和PEG(200)DA，以滿足不同組織和器官的力學(xué)性能。彈性模量增大，吸水率、溶脹率、交聯(lián)率、孔隙率、表面形貌和結(jié)構(gòu)均受到一定影響。特別是GelMA-PEGDA水凝膠，彈性模量顯著增加，吸水率和溶脹率顯著降低。PEG(200)DA的加入加快了反應(yīng)速率，使單體在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為聚合物，也提高了GelMA水凝膠分子之間的交聯(lián)度。水在這個(gè)聚合網(wǎng)絡(luò)中的擴(kuò)散速率會(huì)減慢，導(dǎo)致吸水率顯著降低。ChelMA和GelMA的紫外激活中心較少，光交聯(lián)效率較低，而PEGDA中的雙丙烯酸基團(tuán)提高了交聯(lián)度。通過(guò)在GelMA中加入殼聚糖和PEG(200)DA，可以得出最適宜的GelMA與ChelMA和PEG(200)DA的各種比例，來(lái)滿足多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的多樣化需求，以及滿足生物打印的多種需求，也提高GelMA了作為生物醫(yī)用材料的應(yīng)用需求。