IL-36s在掌跖膿皰病中的作用的研究

李 娜，李東霞，王媚媚，呂新翔

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚性病科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

掌跖膿皰?。╬almoplantar pustulosis，PPP）是屬于皮膚炎癥性疾病中較為多見的一種，疾病特點病程時間長，易反復(fù)發(fā)作，難完全治愈。PPP的病變特征主要存在于掌跖部位，紅斑泛發(fā)，伴隨無間斷發(fā)作的水皰和膿皰，角化及苔蘚樣變、及伴隨大量脫屑[1]。大量國內(nèi)外報道稱PPP的發(fā)病機制與扁桃體炎、牙周炎或金屬過敏的發(fā)病有關(guān)聯(lián)[2]，但具體的治病機理仍未發(fā)現(xiàn)明確的定論。Barber首次提出PPP可以作為銀屑病的一個分型并且Brunasso等[3]從流行病學和臨床表現(xiàn)等方面比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在多個相同點。本實驗通過對20例PPP患者的臨床資料綜合分析后，采用三種不同檢測方法對掌跖膿皰病患者外周血白細胞介素（interleukin，IL）-36s（IL36s）包括IL-36α、IL-36β和IL-36γ 3種細胞因子的表達水平，以及皮損處表皮組織細胞IL-36s變化程度，探討IL-36s在掌跖膿皰病的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

皮損組織均來自2015-01~2015-12醫(yī)院皮膚科門診病房，采集了20例掌跖膿皰病患者，所有病例的確診均符合掌跖膿皰病的診斷標準[4]。同期收集對照組正常者20例，所有受試者在受試前均需簽署知情同意書，上述實驗均通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的許可。

1.2 方法

1.2.1臨床資料和血清及標本收集 所有入組受試者均進行了一系列的相關(guān)確診實驗，并詳細記錄。受試者晨起空腹的外周靜脈血5～7mL，室溫下靜置15～20min，離心4℃、3500r/min、8min，血清分裝保存，于-70℃冰箱備用。掌跖膿皰病患者實驗組與健康對照組組織活檢標本取自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，經(jīng)HE染色病理確診為掌跖膿皰病，標本取出后迅速置于液氮速凍待用。

1.2.2細胞因子測定采用固相夾心ELISA方法檢測受試病人血液中的IL-36α，IL-36β，IL-36γ的濃度以人IL-36s的ELISA試劑盒購買自武漢云克隆科技股份有限公司（SCL621Hu）說明書參照進行試驗。提前取出ELISA試劑盒，于室溫下放置20min，然后制備洗滌劑。首先，將100μL標準品和樣品添加到反應(yīng)板中以獲取標準曲線，并在室溫下孵育2h，然后洗滌并補充100μL在室溫下孵育的檢測抗體。2h后，洗滌并補充100μL的鏈霉親和素-HRP工作稀釋液，在室溫下孵育20min。將板洗滌3次，補充100μL底物，在避光的情況下在室溫下溫育20min，并立即補充終止溶液以終止反應(yīng)。最終通過多模式酶標儀（美國BioTek Instruments）在450nm處測量。

1.2.3免疫組化實驗 免疫組化實驗法，具體步驟如下：（1）4μm的石蠟片采用連續(xù)的切片，均勻的平鋪于APES玻片，置于80℃的烘片機上，烘30min；（2）石蠟片浸入Ⅰ和Ⅱ均為二甲苯的液體，脫蠟分別為10min左右完成；（3）侵入連續(xù)梯度濃度的乙醇：I號：100%-II號：100%-III號：95%-IV號：80%-V號：70%，每個濃度梯度浸泡5min，然后去離子水沖洗2次，每次2min，PBS（pH7.4）沖洗2次，每次2min，進行脫蠟水化；（4）切片侵入檸檬酸緩沖液，進行微波修復(fù)，大火4min轉(zhuǎn)中火10min，冷卻至室溫后，選用pH7.4的PBS洗3遍，總共9min，沖洗時勿破壞皮損組織；（5）將配置好的3%的雙氧水（去離子水稀釋30%雙氧水），置37℃、10～15min。PBS需要沖洗5min；（6）每張切片滴加一滴山羊血清，37℃下孵育15min，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min；（7）去掉血清，吸干，加入一抗，37℃至30min。PBS洗9min；（8）吸干切片，加入辣根過氧化物酶標記二抗，37℃至30min。PBS洗12min；（9）切片滴加顯色液DAB（新配置）；（10）Harris復(fù)染，約1min后水洗，1%濃度鹽酸乙醇分化，洗至藍色；（11）自來水沖洗，切片放入乙醇：70%-80%-95%-100% I-100%II-二甲苯I-II脫水，每個浸入低于2min；（12）收集皮損組織旁加入中性樹脂，蓋玻片蓋好晾干；（13）顯微鏡觀察切片，采集圖像后取陽性對照為質(zhì)控標準；正常皮膚組織為正常對照。

1.2.4IL-36s免疫組化法判定的結(jié)果IL-36s于表皮各層細胞表達強度評定標準：（1）低倍鏡選擇石蠟切片陽性細胞密集、清晰的15個視野，觀察計算陽性細胞/100個細胞高倍鏡下的比例。計算上述比例的平均值，即可得出IL-36s所在細胞的陽性數(shù)量的比例；（2）陽性細胞占比和染色強度評分：①著色細胞占比百分率分為5種5個分值：＜5%：0分，5～25%：1分，26～50%：2分，51～75%：3分，>75%：4分；②按照呈色細胞顏色：0分：無色、1分：淡黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色；③上述兩步相乘分出陽性等級；0分：陰性（—），1～4分：（+），5～8分：（++），9～12分：（+++）。

1.2.5RNA的逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR反應(yīng) 采用RNAiso Plus（Taraka）方法提取人皮膚組織樣本中總RNA，實時定量PCR，（GoTaq qPCR Master Mix Promega、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo）合成cDNA。檢測目的基因，在各樣本中的表達。PCR條件如下：預(yù)變形95℃3min，變形95℃10s，退火60℃20s，延伸72℃20s，循環(huán)45次，每個重復(fù)3次。內(nèi)參GAPDH，2（-ΔCt）計算方法，得出目的基因具體的表達量，PCR引物（見表1）。

表1 IL36s基因的引物序列

1.2 統(tǒng)計學方法

GraphPad Prism8進行F test to compare variances及Ordinary one-way ANOVA分析，檢驗水準為α＝0.05，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。t檢驗用于獨立樣本組間比較，檢驗水準為α＝0.05，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。免疫組化陽性細胞百分比利用卡方檢驗比較，檢驗水準為α＝0.05，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-36s在掌跖膿皰病血清中的表達

ELISA結(jié)果表明，對納入本研究的20例掌跖膿皰病和20例正常者的臨床資料進行比較統(tǒng)計，患者血清中IL-36α濃度顯著的上升[normal：（26.97±25.60）pg/mL VS patient：（595.2±1041.65）pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖1），細胞因子IL-36β和IL-36γ，在健康者和PPP患者血清中濃度無統(tǒng)計學差異[IL-36β normal：（8.02±477.88）pg/mL VS patient：（149.86±512.34）pg/mL]（P>0.05）（見圖2），IL-36γ[normal：（34.02±60.23）pg/mL VS patient：（27.48±83.97）pg/mL]（P>0.05）（見圖3）。

圖1 健康人與PPP患者血清中IL-36α含量比較(pg/mL,mean±SD)

圖2 健康人與PPP患者血清中IL-36β含量比較(pg/mL，mean±SD)

圖3 健康人與PPP患者血清中IL-36γ含量比較(pg/mL，mean±SD)

2.2 PPP患者與健康組表皮組織中IL-36s mRNA的比較

PPP患者表皮組織中IL-36α的表達水平明顯高于正常組，差異存在明顯的統(tǒng)計學意義[（0.0016±0.004）VS 0]（P＜0.01）（見圖4）。IL-36β以及IL-36γ其表達水平在PPP患者和健康組之間無顯著差異（P>0.05）（見圖5、6）。

圖4 健康人與PPP患者組織中IL-36AmRNA比較

圖5 健康人與PPP患者組織中IL-36B mRNA比較

圖6 健康人與PPP患者組織中IL-36G mRNA比較

2.3 免疫組化實驗

2.3.1IL-36s體內(nèi)表達部位 檢測IL-36α的在表皮各層組織中的表達，通過對樣本的免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)PPP患者相對于健康對照組，IL-36α在表皮全層組織中陽性細胞明顯增多，而兩組中IL-36β和IL-36γ兩個炎癥因子的表達在表皮各層中的陽性細胞分布基本相同，且未見明顯增多（見圖8）。

2.3.2表皮中IL-36α表達數(shù)量 患者組和正常組表皮各層細胞中IL-36α表達，陽性率分別為85%（17/20）和10%（2/20），有顯著性差異（P<0.05）。而IL-36β和IL-36γ的表達陽性率在兩組間無顯著差異（P>0.05）（見圖7、圖8A、B、C）。

圖7 健康人與PPP患者表皮細胞中IL-36α染色結(jié)果比較（X40）

2.3.3IL-36s在表皮中陽性比率及表達強度的比較

患者組表皮各層細胞中IL-36α的表達強度（65.2%）高于健康對照組（5.5%）存在顯著差異（P<0.05）（見圖8A）。而IL-36β、IL-36γ在PPP患者組及對照組的表達未見明顯差異（P>0.05）（見圖8B、C）。IL-36α，IL-36β，IL-36γ在同一PPP患者表皮組織中陽性表達的強度存在差異，IL-36α的表達明顯高于后兩者（見圖8D）。

圖8 健康人與PPP患者表皮細胞中IL-36α、IL-36β、IL-36γ含量比較（A，B，C分別表示IL-36α,IL-36β,IL-36γ在PPP患者及健康對照組表皮中陽性細胞比率的差異，D表示IL-36α，IL-36β,IL-36γ在PPP患者表皮組織中陽性表達的強度差異）

3 討論

掌跖膿皰病PPP是較為多發(fā)于掌跖部位，其屬于慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，目前國內(nèi)外關(guān)于誘發(fā)PPP病的病因尚未清楚。PPP發(fā)病與其體內(nèi)多個系統(tǒng)包括免疫系統(tǒng)、精神狀態(tài)以及全身的內(nèi)分泌系統(tǒng)，多功能失調(diào)存有著密切關(guān)聯(lián)。Camp對“膿皰型銀屑病”給出分類，掌跖膿皰病劃分為局限性膿皰型銀屑病。主要發(fā)病年齡在30～60歲，女性居多。其發(fā)病的主要表征為紅斑基礎(chǔ)上，反復(fù)出現(xiàn)無菌性膿皰，并伴有一定量的角化、脫屑以及中度或嚴重瘙癢[6]。

IL-36s：IL-36α、IL-36β和IL-36γ[5]，3個功能相似的生物學分子均屬于IL-1中的一種，人體血液中的IL-36s需要通過與IL-36R這種特異性受體相結(jié)合，才能發(fā)揮促炎作用，IL-36Ra是主要的受體拮抗劑。IL-36s、IL-36R和IL-36Ra三個相關(guān)炎癥因子在皮膚、氣管和食道等上皮組織細胞含量高的部位大量表達[7]。而角質(zhì)的形成是基于免疫細胞中的單核細胞和B細胞等受到應(yīng)激后，活化產(chǎn)生的IL-36s。IL-36s、IL-36R與IL-36Ra三個蛋白組成IL-1家族的一條新的信號傳導(dǎo)通路，在其作用下啟動IL-36s相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮促炎作用，IL-36R和IL-36Ra相結(jié)合的復(fù)合物不能再結(jié)合IL-1 RAcP，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活收到抑制，從而起到抗炎作用[8～12]。IL-36s、IL-36R與PPP的發(fā)病緊密相關(guān)，病理組織的特點：棘層肥厚和真皮內(nèi)炎細胞浸潤，其特點與銀屑病皮損較為一致，且皮損組織處IL-17、IL-22、IL-23和抗菌肽等的基因表達呈明顯增多。銀屑病與掌跖膿皰病在種屬上可以歸為一類，通過相關(guān)報道可知，IL-36β和IL-36γ表達水平在銀屑病發(fā)作期顯著升高，且隨著病情的發(fā)展，IL-36β和IL-36γ表達水平在重度的銀屑病患者體內(nèi)顯著升高，其表達水平的升高是銀屑病發(fā)病機制的重要組成部分[13]，而IL-36α和IL-36Ra血清表達水平?jīng)]有變化，根據(jù)上述的推斷我們設(shè)計并進行了本次實驗，對PPP的疾病過程中IL-36s相關(guān)因子的變化做出了驗證。

我們采用三種方法驗證：（1）ELISA主要檢測PPP的發(fā)病組及正常對照組血清中IL-36α、β和γ三個指標的濃度，結(jié)果顯示：患組和對照組的IL-36β和IL-36γ表達無差異，IL-36α因子表達水平在PPP膿皰發(fā)作期顯著升高，與銀屑病的炎癥因子IL-36表達有所不同；（2）熒光定量PCR法驗證IL-36α表達水平在PPP患者與健康對照組血清中呈高度正相關(guān)；（3）免疫組化方法，在皮損組織處炎癥細胞明顯增多，其中表皮炎癥細胞IL-36α表達顯著增高，以上研究結(jié)果提示，IL-36α、IL-36β和IL-36γ在患者血清中可能有相似的生物學活性，但是對于不同的膿皰性疾病，表達情況會有明顯差異。之前推測的IL-36R在PPP患者中可能參與發(fā)病，鑒于ELISA法和熒光定量PCR法均沒有看出差異，關(guān)于IL-36R在PPP發(fā)病中的影響需要進一步進行詳細的基因檢測和一些體外試驗。

綜上所述，根據(jù)本研究結(jié)果提示IL-36α在PPP血清及組織中均存在高表達，在PPP的發(fā)病過程中可能起到重要作用。但IL-36α在PPP患者血清和皮膚組織中高表達對疾病發(fā)生、發(fā)展有何具體影響，包括IL-36相關(guān)的其它細胞因子在掌跖膿胞病中的作用，尚需擴大樣本量，同時需要豐富檢測方法從而進行更全面更進一步的證實。