響應(yīng)面法優(yōu)化硬毛棘豆總黃酮的提取工藝

劉 洋，丁艷霞，岳 鑫，王曉琴

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

硬毛棘豆（oxytropishirta bunge）為豆科多年生草本植物，又名毛棘豆[1]，地上部分入蒙藥，為“達(dá)克沙”正品藥材[2]，與多葉棘豆功效相同，能殺“粘”，消熱，燥“黃水”，生肌，止血，消腫，通便，用于瘟疫，吐血，咳痰[3]。棘豆屬多種植物的民間用藥歷史悠久，多見(jiàn)于蒙藥、藏藥以及一些草藥典籍收載；國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其中的20余種藥用植物已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究報(bào)道，表明本屬的特征性成分為黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)和生物堿類(lèi)成分，且已從這個(gè)屬分離得到了100多個(gè)黃酮類(lèi)成分[4~6]。目前，硬毛棘豆還沒(méi)有系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，藥理學(xué)研究尚空白。課題組前期對(duì)硬毛棘豆的植化研究表明其富含黃酮類(lèi)化合物，本研究首次采用響應(yīng)面法優(yōu)化了硬毛棘豆中總黃酮的提取工藝，并測(cè)定不同產(chǎn)地硬毛棘豆的總黃酮的方法，以期為硬毛棘豆藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

AL-204型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），UV-1280型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）。

實(shí)驗(yàn)用的9批藥材均為2017-08~2018-08采集于硬毛棘豆的主產(chǎn)地內(nèi)蒙古赤峰市周邊地區(qū)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0080-9705；實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，精密稱(chēng)定，配制成50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，貯藏于4℃冰箱備用。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥的藥材粉末（過(guò)80目篩）0.2 g，精密稱(chēng)定，加入70%乙醇25 mL，超聲60 min，搖勻并過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 吸收波長(zhǎng)的確定

吸取對(duì)照品溶液3 mL和供試品溶液2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入1 mL的1%AlCl3甲醇溶液，用甲醇定容，靜置15 min。以顯色劑為空白，在200~800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示供試品溶液與對(duì)照品溶液在275 nm處均有最大吸收，且干擾較小，故選擇275 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。

圖1 蘆丁對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的吸收波長(zhǎng)掃描

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0 mL分別置于10 mL量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程Y=0.0446 X+0.015（r=0.9993）。結(jié)果表明，蘆丁在2.5~15.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與A值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2精密度試驗(yàn)取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，在275 nm處測(cè)定吸光度A，重復(fù)6次，結(jié)果A分 別 為0.7556、0.7551、0.7555、0.7558、0.7553、0.7550，A值的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24 h后顯色，在275 nm處測(cè)定吸光度A。按“2.4.1”項(xiàng)下計(jì)算總黃酮的含量分別為20.89mg·g-1、20.83mg·g-1、20.85mg·g-1、21.00mg·g-1、21.05mg·g-1、21.09 mg·g-1，RSD為0.52%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取硬毛棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液6份，分別精密量取1 mL供試品溶液于10 mL量瓶中，顯色后，在275 nm處測(cè)定吸光度A，按“2.4.1”項(xiàng)下計(jì)算總黃酮的平均含量為20.49 mg·g-1，RSD為0.35%，表明本實(shí)驗(yàn)采用的方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的硬毛棘豆藥材粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，平行稱(chēng)定9份，分別精密加入相當(dāng)于藥材中總黃酮含量的80 %，100 %，120%倍量的對(duì)照品溶液，平行測(cè)定3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，顯色后，以顯色劑為空白，在275 nm處測(cè)定吸光度A。計(jì)算加樣回收率及RSD，表明該方法準(zhǔn)確度良好（見(jiàn)表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 總黃酮提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1提取方法的考察 取藥材粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定4份（n=2），兩份分別置于50 mL圓底燒瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，加熱回流提取30 min，冷卻，補(bǔ)足減失重量，搖勻并過(guò)濾。另兩份分別置于50 mL具塞錐形瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，補(bǔ)足減失重量，搖勻并過(guò)濾。計(jì)算總黃酮含量分別為17.42mg·g-1、16.98 mg·g-1。由結(jié)果可知，兩種提取方法測(cè)得含量相差不大，考慮操作簡(jiǎn)便快捷，確定提取方法為超聲提取。

2.5.2提取溶劑的考察 取藥材粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定18份（n=2）于50 mL具塞錐形瓶中，分別以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及30%、50%、70%、100%的乙醇各25 mL為提取溶劑，超聲提取30min，結(jié)果可知70%乙醇提取的總黃酮含量最高。

2.5.3超聲時(shí)間的篩選 取藥材粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定12份（n=2），分別超聲提取20min、30min、40min、50min、60min、90 min，其余方法相同。結(jié)果顯示超聲提取時(shí)間選擇60 min為宜。

2.5.4取樣量的篩選分別取藥材粉末約0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5 g，精密稱(chēng)定10份（n=2），超聲提取60 min，其余方法相同。結(jié)果表明，當(dāng)取樣量約為0.2 g時(shí)，提取率保持在20.50mg·g-1，因此選擇0.2 g作為取樣量。單因素試驗(yàn)得出硬毛棘豆中總黃酮的最佳提取條件為取樣量0.2 g，加70%乙醇25 mL，超聲提取60 min。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇影響提取工藝的因素乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、取樣量（C），根據(jù)Boxbehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，因素及水平編碼表（見(jiàn)表2）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表

2.6.2試驗(yàn)結(jié)果 依Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)17組，進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算總黃酮的含量（見(jiàn)表3）。

表3 提取條件(A，B，C)對(duì)總黃酮含量(Y)的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6.3回歸模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)分析并進(jìn)行回歸擬合，得到試驗(yàn)實(shí)際值的二次回歸模型方程：Y=-29.25950+0.97740A+0.50158B+12.60250C+1.47500×10-3AB+0.11250AC-0.055000BC-7.93500×10-3A2-4.86000×10-3B2-41.60000C2。方程模型的相關(guān)系數(shù)（R2=0.9893，P＜0.0001），說(shuō)明模型達(dá)到極顯著（見(jiàn)表4）。同時(shí)，離散系數(shù)較小，為0.46%。模型失擬項(xiàng)（P=0.2328＞0.05），表明失擬不顯著，回歸方程與實(shí)際情況擬合很好。乙醇濃度二次項(xiàng)（A2）、超聲時(shí)間二次項(xiàng)（B2）、取樣量二次項(xiàng)（C2）對(duì)硬毛棘豆中總黃酮含量的影響極顯著（P＜0.01）；超聲時(shí)間（B）、乙醇濃度與超聲時(shí)間交互項(xiàng)（AB）、乙醇濃度與取樣量交互項(xiàng)（AC）對(duì)硬毛棘豆中總黃酮含量的影響顯著（P＜0.05），說(shuō)明改變這些因素水平會(huì)對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生較大的影響。根據(jù)表中F值可知，一次項(xiàng)中對(duì)總黃酮含量影響程度主次的因素為：乙醇濃度>提取時(shí)間>取樣量。

表4 提取條件(A，B，C)對(duì)總黃酮含量的回歸模型方差分析結(jié)果

2.6.4響應(yīng)面分析 根據(jù)上述回歸模型得到對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面圖（見(jiàn)圖2）。當(dāng)固定因素取0水平對(duì)應(yīng)的值時(shí)，總黃酮的含量隨乙醇濃度、超聲時(shí)間和取樣量的增大均呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，響應(yīng)面圖向上凸出，說(shuō)明3個(gè)因素在所選水平范圍內(nèi)均能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值。乙醇濃度（A）和提取時(shí)間（B）的交互作用及乙醇濃度（A）和取樣量（C）的交互作用對(duì)硬毛棘豆中總黃酮含量的影響顯著，表現(xiàn)為圖2Ⅰ、2Ⅱ的等高線圖呈橢圓形，而提取時(shí)間（B）和取樣量（C）的交互作用對(duì)總黃酮含量的影響不顯著，表現(xiàn)為圖2Ш的等高線圖接近于圓形。以上結(jié)果與表4數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

圖2 乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)和取樣量(C)之間交互作用對(duì)總黃酮含量的影響

2.6.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Design-Expert 10.0.7軟件分析獲得硬毛棘豆中總黃酮提取的最佳條件為：乙醇濃度為69.5%，超聲時(shí)間為60.8 min，取樣量為0.2 g，在此最佳提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)（見(jiàn)表5）。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)相符，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面進(jìn)行分析的數(shù)據(jù)可靠性強(qiáng)。

表5 最佳提取條件獲得總黃酮含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值對(duì)比

2.7 硬毛棘豆總黃酮的含量測(cè)定

取9批硬毛棘豆藥材樣品約0.2 g，平行3份，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色后，以顯色劑為空白，在275 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算總黃酮的含量（見(jiàn)表6）。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

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3 結(jié)語(yǔ)

Al（NO3）-NaNO2-NaOH比色法、AgCl3比色法、三乙胺顯色法、氫氧化鉀顯色法等是最為常用的測(cè)定中藥中總黃酮的方法[7~10]。本研究分別對(duì)上述4種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果供試品溶液在AgCl3顯色法顯色后最大吸收峰較為明顯，所以將AgCl3顯色法定為測(cè)定硬毛棘豆總黃酮含量的顯色方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，測(cè)定了9批野外采集的硬毛棘豆藥材的總黃酮含量。

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。以硬毛棘豆中總黃酮含量為指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)并進(jìn)行分析，得出硬毛棘豆中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度69.5%，超聲時(shí)間60.8 min，取樣量0.20 g，結(jié)合實(shí)際操作，得到最佳條件下總黃酮含量為（20.84±0.07）mg·g-1，與預(yù)測(cè)結(jié)果相似，證明響應(yīng)曲面法所構(gòu)建的模型可靠[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為硬毛棘豆中總黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝具有一定的指導(dǎo)意義。