pSTAT1與PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達及相關性研究

楊宏坤，劉 霞,2，施 琳,2，賈永峰,2，云 芬,2

（1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科）

三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和Her2均陰性的一類乳腺癌（breast cancer，BC）亞型。TNBC具有高度異質(zhì)性和侵襲轉(zhuǎn)移能力[1]，對常規(guī)內(nèi)分泌治療和化療藥物不敏感，因而預后較差。TNBC具有的高突變率引起免疫原性增加以及更多的免疫細胞浸潤[2]。在正常組織中，信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子-1（activator of transcription，STAT1）能傳遞多種細胞因子和生長因子的信號，促進免疫激活、抑制免疫過激，維持機體正常的免疫功能[3]。STAT1具有活性（pSTAT1）與非活性（uSTAT1）兩種狀態(tài)，pSTAT1僅在激活后數(shù)小時內(nèi)能被檢測到[4，5]。2-（1，8-萘啶-2-基）苯酚又稱為2-NP，通過促進STAT1 Tyr701（酪氨酸）位點的磷酸化，維持pSTAT1的持續(xù)表達[6]。細胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1），是早發(fā)現(xiàn)的一個重要免疫檢查點，以PD-L1為免疫檢測指標的腫瘤靶向治療藥物已投入臨床應用，提高腫瘤中PD-L1的表達可以為免疫治療提供有效的靶點[7]。本實驗檢測pSTAT1與PD-L1在TNBC中的表達并探討其相關性，為TNBC的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）標本選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2017～2019年經(jīng)病理確診的120例乳腺癌組織，其中50例TNBC組織，70例非non-TNBC組織，收集同期36例乳腺良性病變（腺病）組織，所有病例術(shù)前均未經(jīng)過放化療治療且臨床資料完整；（2）細胞選取MDAMB-468和MCF-7人乳腺癌細胞系，均購于中國醫(yī)學科學院，其中MDA-MB-468為TNBC細胞系，MCF-7為non-TNBC細胞系；（3）實驗試劑，抗體使用Phospho-Stat1兔單克隆抗體（Tyr701）（58D6）和PD-L1兔單克隆抗體（E1L3N）XP，均購自Cell Signaling Technology（CST）公司；即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTM SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；2-NP購自上海陶素生物科技有限公司；qRT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；引物購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

免疫組化采用EnVision法，經(jīng)過脫蠟，抗原修復，3%雙氧水封閉，山羊血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素染色，脫水透明，封片；操作過程嚴格按照產(chǎn)品說明書進行；pSTAT1使用EDTA微波熱修復，抗體稀釋比例為1：800；PD-L1使用檸檬酸微波熱修復，抗體稀釋比例為1：200。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），使用DMEM基礎培養(yǎng)基、滅活胎牛血清（FBS），按9：1的比例配制成完全培養(yǎng)基，于一定濕度的37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)MCF-7和MDA-MB-468細胞，當細胞長至培養(yǎng)瓶85%～90%，并且細胞狀態(tài)良好時，對照組經(jīng)2-NP（45uM）處理一小時后，提取對照組與正常對照組（DMSO組）中的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測MCF-7、MDA-MB-468細胞系處理組與對照組中PD-L1和IRF-1的相對表達量。所用引物序列：PD-L1：F-TGGCATTTGCTGAACGCATT、R-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT，IRF-1：F-CGGGGCTCATCTGGATTAATAA、R-GGTCTTTCACCTCCTCGATATC，β2MG（內(nèi) 參）：F-TGTTGCCATCAATGACCCCTT、R-CTCCACGACGTACTCAGCG

1.3 結(jié)果判定

乳腺癌組織中，pSTAT1表達于癌細胞以及免疫細胞的細胞核中，部分細胞質(zhì)伴有少量表達，以癌細胞核陽性作為判讀指標；PD-L1表達于癌細胞以及免疫細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中，以癌細胞膜陽性作為判讀指標。乳腺腺病中，以腺上皮細胞核（pSTAT1）或細胞膜（PD-L1）陽性為陽性指標。

免疫組化采用腫瘤細胞陽性比例分數(shù)（tumor proportion score，TPS）打分，隨機選取10個高倍鏡視野（×400），每個視野最少計數(shù)100個腫瘤細胞，然后計算每個高倍視野中陽性細胞的百分比，再算出10個視野的平均百分率，以TPS≥1%為陽性，0

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，比較采用χ2檢驗、Spearman相關性分析、方差分析以及Fisher確切概率法進行數(shù)據(jù)分析，檢驗水準為α=0.05，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 pSTAT1與PD-L1在TNBC組織中的表達

2.1.1pSTAT1在乳腺癌中的表達（見圖1）根據(jù)TPS打分標準，BC陽性率為27.5%，TNBC陽性率為44%，non-TNBC陽性率15.7%，乳腺腺病不表達pSTAT1，陽性率為0（pSTAT1在腺上皮細胞中不表達，肌上皮細胞鮮有表達，以腺上皮細胞核陽性為判讀標準）；與non-TNBC相比TNBC表達水平顯著升高，且具有統(tǒng)計學差異（χ2=11.7，P=0.001<0.05）（見表1）。

表1 pSTAT1在乳腺癌和乳腺腺病組織中的表達情況Tab.1 TheexpressionofpSTAT1inbreastcancerandbenigntissues

2.1.2在TNBC中pSTAT1陽性病例具有多種特殊表達模式（1）陽性腫瘤細胞以點灶狀分散在癌巢中（見圖1A）占總陽性病例數(shù)40.9%；（2）陽性腫瘤細胞集中在腫瘤巢團與間質(zhì)交界處（見圖1B）占總陽性病例數(shù)27.3%；（3）部分病例中可觀察到癌巢呈彌漫表達（見圖1C），占總陽性病例數(shù)18.2%；（4）而較少的病例中可出現(xiàn)點灶和交界模式混合表達，占總陽性病例數(shù)13.6%（見圖1D、表2），以上四種模式可以概括為，散在點灶狀分布、癌巢邊緣分布、彌漫表達和混合表達。

圖1 pSTAT1在乳腺癌中的表達Fig.1 The expression of pSTAT1 in breast cancer

表2 pSTAT1在乳腺癌中的表達模式及其比例分布Tab.2 Theexpressionpatternandproportiondistributionof pSTAT1inbreastcancer

2.1.3PD-L1在乳腺癌中的表達（見圖2A）結(jié)果判讀采用TPS打分標準，120例乳腺癌陽性率為9.23%，TNBC陽性率為22.0%，non-TNBC陽性率為2.9%，36例乳腺腺病陽性率為0（以腺上皮細胞膜陽性為判讀標準）；PD-L1在TNBC和non-TNBC中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=7.41，P=0.001<0.05）（見表3）。

圖2 PD-L1在乳腺癌中的表達Fig.2 Expression of PD-L1 in breast cancer

表3 PD-L1在乳腺浸潤性癌和乳腺腺病組織中的表達情況Tab.3 TheexpressionofPD-L1inbreastinvasivecarcinomaand benignlesions

2.1.4pSTAT1與PD-L1表達的相關性分析TNBC中pSTAT1與PD-L1表達位置相似，二者可能存在共表達（見圖3）；通過統(tǒng)計學分析，pSTAT1與PDL1的表達具有相關性（r=0.507，P<0.05）（見表4）。

圖3 乳腺癌中PD-L1和pSTAT1的表達Fig.3 The expression of PD-L1 and pSTAT1 in breast cancer

表4 pSTAT1與PD-L1表達的相關性分析Tab.4 CorrelationanalysisofpSTAT1andPD-L1positive expression

2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測IRF-1和PD-L1的相對表量

經(jīng)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，MCF-7、MDAMB-468的處理組中PD-L1的相對表達量均高于對照組，MDA-MB-468處理組中PD-L1的表達量為對照組的4.234倍，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；MCF-7處理組中PD-L1的表達量為對照組的2.75倍，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；MDA-MB-468中IRF-1的表達量為對照組的6.682倍，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；MCF-7中IRF-1的表達量為對照組的1.171倍，處理組與對照組相比不具有統(tǒng)計學差異（P>0.05）；MDA-MB-468較MCF-7中IRF-1和PD-L1的表達量增高的更為顯著（見表5、圖4）。

表5 IRF-1和PD-L1的相對表達量Tab.5 RelativeexpressionlevelsofIRF-1andPD-L1

圖4 IRF-1和PD-L1的相對表達量Fig.4 Relative expression of IRF-1 and PD-L1

3 討論

早在1902年，STAT1就開始被關注和研究。STAT1除具有激活機體抗炎、抗腫瘤免疫反應外，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等密切相關[8～10]，如腎癌、肺腺癌以及胰腺癌中，高表達的STAT1與患者的生存期（overall survival，OS）低有關，特別是在腎癌中STAT1表達的增加與高級別、晚期、體積較大的腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關[9]。與STAT1表達低或不表達的乳腺癌患者相比，高表達STAT1的患者預后更差[6]，STAT1在腫瘤中的功能并非始終處于良性端。通常情況下，STAT1以非活性（uSTAT1）的無功能形式存在，僅在激活后數(shù)小時內(nèi)以活性（pSTAT1）狀態(tài)存在并發(fā)揮其傳導和轉(zhuǎn)錄功能[4]。目前，活性狀態(tài)的pSTAT1在TNBC中的研究較少，其功能和意義尚無明確解釋。

本研究中發(fā)現(xiàn)，pSTAT1在TNBC中存在特異性激活，并且具有四種不同的表達模式，pSTAT1高表達的腫瘤細胞周圍常伴有較多的免疫細胞，推測腫瘤細胞中pSTAT1的表達可能是受到相鄰免疫細胞的激活。STAT1的活化受到IFN-γ等細胞因子的作用，而激活的免疫細胞分泌大量的細胞因子[8]。通過以上分析發(fā)現(xiàn)，pSTAT1的表達模式可能反應了腫瘤中免疫細胞浸潤的程度。（1）點灶狀，表現(xiàn)為pSTAT1陽性的腫瘤細胞呈片狀或小灶狀表達于腫瘤巢團內(nèi)；可能是由于少量的免疫細胞分散浸潤于癌巢中，相鄰腫瘤細胞受到激活持續(xù)表達pSTAT1（見圖1A）；（2）癌巢邊緣表達模式，表現(xiàn)為pSTAT1高表達在癌巢與間質(zhì)交界處的的腫瘤細胞中，這一類型的癌巢周邊常伴有較多的免疫細胞浸潤，但免疫細胞很少侵入癌巢中（見圖1B），推測免疫細胞分布在癌巢周圍，因此刺激腫瘤邊緣細胞高表達pSTAT1；（3）彌漫表達，推測是由于大量的免疫細胞浸潤于癌巢中，引起pSTAT1彌漫表達（見圖1C）；（4）混合表達，癌巢邊緣與點灶狀模式同時表達，可能是由于免疫細胞包圍并浸潤到癌巢中，激活相鄰腫瘤細胞高表達pSTAT1（見圖1C）。

既往研究表明，PD-L1抑制T細胞功能，傳導免疫抑制信號，是腫瘤免疫逃逸的關鍵機制之一[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與non-TNBC相比，TNBC中高表達PD-L1，PD-L1的高表達可能協(xié)助TNBC免受微環(huán)境中的免疫攻擊和控制。對比發(fā)現(xiàn)，pSTAT1與PDL1在TNBC中的表達分布一致，二者可能存在共表達（見圖3）；通過統(tǒng)計學分析，pSTAT1與PD-L1的表達具有相關性（P<0.05）。

為了進一步證實二者的相關性，我們使用STAT1激活劑2-NP處理人乳腺癌細胞系MDAMB-468和MCF-7，觀察PD-L1和IRF-1的表達。由于2-NP對核因子（NF）κB、STAT3無作用，因此對STAT1具有特異性[12，13]。結(jié)果顯示，與對照組相比，2-NP處理后兩種細胞系中的PD-L1表達均上調(diào)，證實乳腺癌中pSTAT1與PD-L1具有正相關性。MCF-7中處理組IRF-1表達量高于對照組，但差異不具有統(tǒng)計學意義，MDA-MB-468較MCF-7中IRF-1和PD-L1的表達量增高的更為顯著（見圖4），提示TNBC中pSTAT1高表達可能會誘導STAT1-IRF1-PDL1通路的激活；而non-TNBC中pSTAT1與PD-L1雖具有正相關性，但可能尚存在其他通路。已有最新實驗證實，在惡性黑色素瘤及卵巢癌中存在STAT1-IRF1-PDL1通路級聯(lián)激活，誘導免疫檢查點配體PD-L1的高表達[14，15]。STAT1作為機體下放免疫信號的重要調(diào)節(jié)因子，不僅能夠激活免疫系統(tǒng)，在炎癥后期通過限制免疫反應，避免免疫過激也起到重要作用，STAT1相關的炎癥級聯(lián)反應是調(diào)節(jié)這一免疫平衡的關鍵[4]。TNBC可能利用STAT1的免疫調(diào)節(jié)能力，持續(xù)性高表達pSTAT1，進而上調(diào)PD-L1的表達，協(xié)助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的識別與攻擊，最終產(chǎn)生免疫逃逸。這或許能夠在某種程度上解釋適應性免疫系統(tǒng)不能識別和破壞高免疫原性腫瘤細胞的原因。

綜 上 所 述，pSTAT1和PD-L1在TNBC中 高 表達，pSTAT1促進了PD-L1在TNBC中表達，pSTAT1有望成為TNBC免疫治療的重要靶標，為TNBC臨床治療提供新的策略。