不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的研究

尹震 張曉琳 田金英 姜楠 李雪晨 葉菲

摘 要：目的：比較不同種類的脂肪酸對人肝癌細(xì)胞（HepG2）脂質(zhì)堆積的影響。方法：HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為對照組（Con）、棕櫚酸組（PA）、油酸組（OA）、亞油酸組（LA）和亞麻酸組（ALA）。培養(yǎng)24 h后，以MTT法比較不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞存活率的影響;同一濃度下，以油紅O染色法比較，各組細(xì)胞內(nèi)脂滴生成情況拍照并測量吸光度;以酶學(xué)法檢測各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量比較不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響。結(jié)果：確定了每種脂肪酸誘導(dǎo)的濃度為50 μmol/L，同一濃度下，隨著PA、OA、LA、ALA各組脂肪酸的不飽和度依次增加，PA、OA、LA、ALA各組細(xì)胞內(nèi)脂滴依次增多，細(xì)胞內(nèi)TG含量依次升高。與對照組相比，PA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，OA存在顯著性差異（P<0.05），而LA和ALA分別存在極顯著性差異（P<0.001）。且對每種脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均存在顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：同一條件下，不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞活力和脂質(zhì)堆積程度的影響不同，提示可能與脂肪酸的不飽和度有關(guān)，不飽和度越高的脂肪酸對細(xì)胞脂質(zhì)堆積作用越明顯。

關(guān)鍵詞：脂肪酸;肝細(xì)胞;細(xì)胞活力;脂質(zhì)堆積

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是指無明確過量飲酒史和其他致病因素，以肝臟內(nèi)脂肪過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征，其疾病譜包括單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、纖維化、肝硬化和肝癌[1]。在發(fā)達(dá)國家，NAFLD 的發(fā)病率已達(dá)到 20%～30%，在發(fā)展中國家，NAFLD 的發(fā)病率也在逐漸上升[2]。隨著人們生活方式、膳食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD 已成為世界范圍內(nèi)常見的慢性疾病之一。目前，對NAFLD 的治療尚無良好的藥物，在其NAFL 階段多采用控制飲食、增加運(yùn)動(dòng)的方法，發(fā)展到NASH 階段多以保肝類藥物和對癥治療為主，均不能滿足廣大患者的需求。NAFLD 的主要病因是胰島素抵抗等因素引起肝臟脂代謝紊亂，脂類尤其是甘油三酯（TG）在肝臟的堆積。當(dāng)肝臟 TG 的含量超過肝重的5%時(shí)，便認(rèn)為NAFLD發(fā)生[3]。

膳食脂肪酸攝入過多是導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝失衡的首要原因[4]。脂肪酸，是指一端含有一個(gè)羧基的長的脂肪族碳?xì)滏湹挠袡C(jī)物，根據(jù)碳鏈中碳原子間雙鍵的數(shù)目可將脂肪酸分為飽和脂肪酸（SFA）（不含雙鍵）、單不飽和脂肪酸（MUFA）（含1個(gè)雙鍵）和多不飽和脂肪酸（PUFA）（含1個(gè)以上雙鍵）三類[5]。當(dāng)機(jī)體處于肥胖、2 型糖尿病等代謝異常狀態(tài)下，肝臟的脂質(zhì)輸入和輸出的平衡被打破，最終導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂質(zhì)的堆積和脂肪肝的形成[6]。因此，NAFLD 的防治策略中，抑制脂肪在肝臟中的堆積顯得尤為重要。

脂肪酸主要在肝臟內(nèi)代謝，然而在生理?xiàng)l件下獲得人肝臟細(xì)胞非常困難，且正常人肝臟細(xì)胞個(gè)體差異大，難于穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)，因此不利于長期研究肝臟脂質(zhì)代謝。人肝癌細(xì)胞株HepG2是目前常用的研究體外脂代謝細(xì)胞模型[7]。應(yīng)用外源性脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞形成脂質(zhì)堆積模型，從而進(jìn)行降脂藥物的體外篩選及其作用機(jī)制的研究。

有軟脂酸又稱棕櫚酸，是一種飽和高級脂肪酸，以甘油酯的形式廣泛存在于各種油脂中，是細(xì)胞膜的重要組成成分，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞形成胰島素抵抗模型。油酸為MUFA中最為代表性的一種脂肪酸，廣泛存在于動(dòng)物脂肪和植物油中，在魚油、棕櫚油、橄欖油等中含量較高。PUFA中的亞油酸和α-亞麻酸在體內(nèi)不能自身合成，需由食物提供，所以這些脂肪酸又稱為必需脂肪酸[8]。研究表明，膳食脂肪攝入過多、膳食脂肪酸不平衡等是導(dǎo)致脂肪肝的主要危險(xiǎn)因素[9-10]。眾所周知，不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響不同[11]，但目前為止，未有各種脂肪酸對肝細(xì)胞HepG2的作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究。尤其是針對不飽和程度不同的脂肪酸在肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積形成過程中的作用鮮見報(bào)道。不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積產(chǎn)生不同影響的原因是否和脂肪酸本身的不飽和程度有關(guān)，是一個(gè)值得研究的課題。故本研究采用具有代表性的棕櫚酸（PA，飽和脂肪酸）、油酸（OA，單不飽和脂肪酸）、亞油酸（LA，多不飽和脂肪酸，含2個(gè)雙鍵）、α-亞麻酸（ALA，多不飽和脂肪酸，含3個(gè)雙鍵）分別刺激HepG2細(xì)胞，比較了不飽和度不同的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜（DMSO）、MEM培養(yǎng)基，Gibco公司;PA、OA、LA、ALA、脫脂牛血清白蛋白（BSA）、油紅O染液，美國Sigma公司;四甲基偶氮唑鹽（MTT），Amresco公司;TG 測定試劑盒，北京普利萊基因生物技術(shù)公司。

酶標(biāo)儀μ-Quant，美國BIO-TEK公司;磁力攪拌器，德國IKA公司;THZ-C型全溫空氣恒溫振蕩器，太倉科教儀器廠;高速低溫離心機(jī)，德國Heraus公司;電子天平，德國賽多利斯公司;超低溫冰箱，日本SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人HepG2肝癌細(xì)胞株，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的MEM高糖培養(yǎng)基，37℃（5%CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%密度時(shí)用胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代。

1.2.2 脂肪酸儲(chǔ)備液的配置（10 mmol/L） 準(zhǔn)確稱取4種脂肪酸，分別溶解到含5%BSA的PBS緩沖液中，使每種脂肪酸的終濃度為10 mmol/L，充分?jǐn)嚢?，?0℃的水浴鍋中加熱10 min，過濾除菌，4℃保存。

1.2.3 細(xì)胞存活率測定 實(shí)驗(yàn)分為5組，對照組（Con）添加與脂肪酸組終濃度相同的BSA作溶劑對照，PA、OA、LA和ALA。將對數(shù)期生長的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，接種96孔板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，棄上清，PBS潤洗，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，各組加入終濃度為1、10、50、100、150、200、250 μmol/L不同種類的脂肪酸分別處理HepG2細(xì)胞24 h。MTT法測定細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值×100%（1）

1.2.4 油紅O染色 實(shí)驗(yàn)分為5組，Con添加與脂肪酸組終濃度相同的BSA作溶劑對照，PA、OA、LA和ALA。將對數(shù)期生長的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，接種96孔板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，棄上清，PBS潤洗，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，終濃度為50 μmol/L不同種類的脂肪酸處理細(xì)胞24 h之后，棄上清，PBS洗滌2遍，用4%多聚甲醛固定10 min，0.5%油紅O染液室溫染色15 min，60%異丙醇漂洗30 s，蒸餾水洗30 s至背景透明。于倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況后，用異丙醇提取，在510 nm處測定吸光度值，吸光度值直接反映細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的多少進(jìn)一步評價(jià)脂質(zhì)堆積程度[12]。

1.2.5 胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量的測定 將對數(shù)期生長的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，接種6孔板，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，棄上清，PBS潤洗，實(shí)驗(yàn)分為5組，Con、PA、OA、LA、ALA，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，Con添加與脂肪酸組終濃度相同的BSA作溶劑對照，其余每組加入終濃度為50 μmol/L的脂肪酸分別處理HepG2細(xì)胞24 h，收取細(xì)胞后用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)TG含量，結(jié)果用蛋白濃度校準(zhǔn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)通過t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞存活率的影響

為了評估4種脂肪酸對HepG2的細(xì)胞毒作用，用MTT法測定了不同濃度的4種脂肪酸分別對肝細(xì)胞存活率的影響。如圖1所示，終濃度為1～250 μmol/L不同種類的脂肪酸分別處理HepG2細(xì)胞，PA隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率降低，但均高于80%;OA隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率均高于80%;LA當(dāng)濃度為150～250 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均低于80%;ALA濃度為100～250 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率均低于80%。在一定劑量（0～50 μmol/L）范圍內(nèi)，4種脂肪酸對HepG2細(xì)胞活力影響不大（細(xì)胞存活率>80%），所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用濃度為50 μmol/L的脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞。

2.2 不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響

如圖2所示，油紅O半定量結(jié)果表明，與Con相比，PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Con相比，OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.14倍（P<0.05），LA、ALA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度分別顯著升高了0.25、0.31倍（P<0.001）。與PA相比，OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.09倍（P<0.05），LA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.19倍（P<0.01），ALA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.25倍（P<0.001）。與OA相比，LA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.09倍（P<0.05），ALA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.15倍（P<0.01）。與LA相比，ALA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積程度顯著升高了0.05倍（P<0.05）。根據(jù)油紅O半定量結(jié)果可知，同一濃度下，不飽和度不同的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度影響不同。

每組加入終濃度為50 μmol/L的脂肪酸分別處理HepG2細(xì)胞24 h，進(jìn)行油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測。如圖3（a）所示，Con、PA、OA、LA、ALA各組細(xì)胞內(nèi)脂滴依次增多。收集細(xì)胞，用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)TG含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致。如圖3（b）所示，與Con相比，PA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量無顯著性差異，OA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.33倍（P<0.05，LA和ALA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TG含量分別顯著升高了1.17、1.38倍（P<0.001）;與PA相比，OA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.16倍（P<0.05），LA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.89倍（P<0.001），ALA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了1.07倍（P<0.001）;與OA相比，LA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.63倍（P<0.001），ALA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.79倍（P<0.001）;與LA相比，ALA誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高了0.1倍（P<0.05）。油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測結(jié)果顯示，同一濃度下，隨著PA、OA、LA、ALA各組脂肪酸的不飽和度依次增加，PA、OA、LA、ALA各組細(xì)胞內(nèi)脂滴依次增多，細(xì)胞內(nèi)TG含量依次升高，且每種脂肪酸之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均存在顯著性差異（P<0.05）。由此可以得出，同一濃度下，不飽和度不同的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度不同。由此推測不飽和度越高的脂肪酸對細(xì)胞脂質(zhì)堆積作用越明顯。

3 討論

NAFLD是與胰島素抵抗、肥胖和脂質(zhì)代謝異常等密切相關(guān)的代謝性肝損傷疾病[13-15]。在NAFL及NASH階段，其病程是可逆的，但當(dāng)疾病進(jìn)入肝纖維化以后，病程將很難逆轉(zhuǎn)。NAFLD 已經(jīng)成為全球的主要公共問題之一。15%～30%的成年人有NAFLD，而在肥胖和糖尿病群體中，70%以上有NAFLD，可見NAFLD對人類健康的威脅非常大。NAFLD的病因和發(fā)病機(jī)理一直存在爭議，且迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)治療 NAFLD的特效藥物[16]。盡管大多數(shù)單純性脂肪肝患者短期內(nèi)無明顯肝功能損傷，但長期的脂肪肝有發(fā)展成NASH，肝硬化甚至肝癌的危險(xiǎn)[17]，可見NAFLD已嚴(yán)重威脅人類的身體健康，必須引起高度重視。膳食脂肪酸攝入過多或脂肪酸不平衡，可導(dǎo)致血漿中飽和脂肪酸升高，使肝臟脂肪蓄積增多。膳食脂肪酸包括SFA、MUFA和PUFA，它們是細(xì)胞膜的重要組成部分，在一定條件下維持機(jī)體血糖和血脂的相對穩(wěn)定[18]。肝臟是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要場所[19]，機(jī)體攝入脂肪酸的種類和數(shù)量能夠影響肝臟在糖脂代謝中的調(diào)控作用。

探究不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的作用十分重要，針對作用不同的脂肪酸我們可以靶向的進(jìn)行降脂藥物的體外篩選實(shí)驗(yàn)，同時(shí)明確不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞的作用機(jī)制可以指導(dǎo)人們合理搭配膳食脂肪酸的種類以預(yù)防和緩解疾病的發(fā)生?；谝陨戏治?，本研究選用PA（飽和脂肪酸）、OA（單不飽和脂肪酸）、LA（多不飽和脂肪酸，含2個(gè)雙鍵）、ALA（多不飽和脂肪酸，含3個(gè)雙鍵）分別刺激HepG2細(xì)胞，通過MTT、油紅O染色、細(xì)胞內(nèi)TG測定等實(shí)驗(yàn)，觀察不同不飽和度、同一劑量下的外源性脂肪酸對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響。

MTT實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞的活性強(qiáng)度[20]，根據(jù)MTT結(jié)果確定了每種脂肪酸誘導(dǎo)的濃度為50 μmol/L，以比較不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響。油紅O是脂肪染色的最敏感染料[21]，可將細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)染成紅色，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的多少可反映細(xì)胞脂質(zhì)堆積的程度。根據(jù)油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過半定量檢測和鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況，可以直觀地看出每種脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量存在明顯的差異。

在不同種類脂肪酸對肝細(xì)胞內(nèi)TG含量影響的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致，而利用試劑盒測定的細(xì)胞內(nèi)TG含量更為精確。不同種類脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)TG含量隨著4種脂肪酸不飽和度的升高而升高，與對照組相比，飽和脂肪酸PA的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單不飽和脂肪酸OA的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度存在顯著性差異（P<0.05），而多不飽和脂肪酸LA和ALA的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度分別存在極顯著性差異（P<0.001），且對每種脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均存在顯著性差異（P<0.05）。

綜上所述，不同種類的脂肪酸對肝細(xì)胞活力和脂質(zhì)堆積程度的影響不同，提示可能與脂肪酸的不飽和程度有關(guān)，不飽和度越高的脂肪酸對細(xì)胞脂質(zhì)堆積作用越明顯，這一結(jié)論為今后建立不同種類脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積藥物篩選模型提供了方向，但本實(shí)驗(yàn)針對每種脂肪酸僅選取了其中具有代表性的一種進(jìn)行研究，今后還應(yīng)增加研究深度并進(jìn)一步探討脂肪酸影響肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的作用機(jī)制?！?/p>

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Effects of Different Types of Fatty Acids on Lipid Accumulation in Hepatocytes

YIN Zhen，ZHANG Xiao-lin，TIAN Jin-ying，JIANG Nan，LI Xue-chen，YE Fei

（Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College Center for Drug Evaluation/Beijing Key Laboratory of New Drug Action Mechanism and Evaluation，Beijing 100050，China）

Abstract：ObjectiveTo compare the effects of different types of fatty acids on lipid accumulation in human liver cancer cells （HepG2）.MethodHepG2 cells were randomly divided into control group （Con），palmitic acid group （PA），oleic acid group （OA），linoleic acid group （LA）and linolenic acid group （ALA）.After 24 h culture，the effects of different fatty acids on the survival rate of hepatocytes were compared by MTT method.At the same concentration，the formation of lipid droplets in each group was photographed and the absorbance was measured by oil red O staining.The effects of different fatty acids on lipid accumulation in hepatocytes were compared by enzymatic method.ResultThe concentration induced by each fatty acid was determined to be 50 μmol/L.At the same concentration，as the fatty acid unsaturation of PA，OA，LA and ALA increased successively，the intracellular lipid droplets of PA，OA，LA and ALA increased successively，and the intracellular TG content increased successively.Compared with the control group，there was no statistical difference in PA，a significant difference in OA （P<0.05），and a very significant difference in LA and ALA （P<0.001）.Moreover，statistical analysis of the lipid accumulation degree of each fatty acid induced hepatocytes showed significant differences （P<0.05）.ConclusionUnder the same condition，different types of fatty acids have different effects on liver cell viability and lipid accumulation degree，suggesting that fatty acid unsaturation may be related to the degree of unsaturation of fatty acid.The higher the degree of unsaturation，the more obvious the effect of fatty acids on lipid accumulation.

Keywords：fatty acid;liver cell;cellular viability;lipid accumulation