動物雙歧桿菌A12的腸道動態(tài)分布規(guī)律及其對便秘緩解效果研究

馬京升，任培豪，任 穎，金君華，劉 慧

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 102206)

人體腸道內(nèi)存在大量細(xì)菌定殖在腸道黏膜表面，與腸道黏膜細(xì)胞共同構(gòu)成生物屏障，保護(hù)機(jī)體健康。已有研究證明，服用外源性益生菌，對維持機(jī)體微生態(tài)平衡、抑制病原微生物侵襲、調(diào)節(jié)免疫預(yù)防方面有重要作用[1]。然而口腔中各種消化酶、腸道中的強(qiáng)酸高膽鹽環(huán)境給益生菌的生存帶來很大的壓力，所以，益生菌要定殖在腸道黏膜表面，與宿主共同抵制外來致病微生物的侵襲，就必須克服重重阻力。在口服益生菌后，了解其在胃腸道中各部分不同時間點的總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)，及連續(xù)口服一段時間后，菌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的保留與排空情況很有必要。不同菌種甚至不同菌株之間穿過胃腸道的能力有所不同[2]，所以在評價一株益生菌時，了解其穿過胃腸道并存活的能力以及其分布和數(shù)量尤為重要。

FENG等[3]應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分別檢測便秘患者糞便標(biāo)本和結(jié)腸黏膜菌群發(fā)現(xiàn)，糞便標(biāo)本中雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬水平明顯低于健康人群，結(jié)腸黏膜中雙歧桿菌屬存在相同的變化。此外，一項羅馬基金會的研究報告顯示，便秘型腸易激綜合征患者腸道菌群改變主要表現(xiàn)為雙歧桿菌屬、梭菌屬和柔嫩梭菌屬顯著減少[4]。大量研究表明，補(bǔ)充含有雙歧桿菌的混合益生菌制劑可預(yù)防或治療便秘，但單菌株雙歧桿菌的緩解便秘作用效果不確定[5]，有研究發(fā)現(xiàn)單獨使用乳酸雙歧桿菌NCC2818對治療功能性便秘?zé)o效[6]。

前期研究結(jié)果表明，動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)A12可以顯著控制大鼠由于高糖高脂食物引起的血糖升高及體質(zhì)量增加等癥狀[7]，具有良好的商業(yè)化應(yīng)用前景，但該菌株在胃腸道的存活及其對腸道功能的影響尚未研究報道。

本研究以動物雙歧桿菌A12為研究對象，基于大鼠腸道菌群環(huán)境下，設(shè)計動物雙歧桿菌A12特異性引物，檢測一次攝入該菌株后，其在腸道各部位的動態(tài)存活細(xì)胞數(shù)，及連續(xù)攝入后其在腸道的存活時間，探討動物雙歧桿菌A12在腸道動態(tài)分布規(guī)律；進(jìn)一步利用小鼠便秘模型，探討該菌株緩解功能性便秘的能力，為具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)雙歧桿菌菌株產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 菌株及處理方法

動物雙歧桿菌A12(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物功能開發(fā)團(tuán)隊自主分離，保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC 17308)，分離于母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道。

動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞：將動物雙歧桿菌A12在改良MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，每12 h做一次傳代活化，將活化好的3代菌培養(yǎng)液，倒入離心管中5 000 r/min離心15 min，將離心好的動物雙歧桿菌A12沉淀重懸于等體積的生理鹽水中備用。

動物雙歧桿菌A12死菌細(xì)胞：按照“1.1”中配置動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞的方法，得到重懸于生理鹽水中有活性的動物雙歧桿菌A12菌液后，再用滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到死菌細(xì)胞所需要的菌液。

1.2 試驗動物

用于菌株腸道分布研究：SPF級SD大鼠(質(zhì)量合格證編號1103241911037614)，42日齡，雄性，體質(zhì)量250～260 g，購于北京興隆動物廠，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室動物房，室溫24 ℃，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由飲水?dāng)z食，每天補(bǔ)充大鼠維持飼料，購自北京興隆動物廠。

用于便秘緩解作用研究：SPF級Balb/c雄性小鼠(質(zhì)量合格證編號1103241911038195)，42～56日齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室動物房，室溫24 ℃，12 h光照/黑暗循環(huán)，每天補(bǔ)充小鼠基礎(chǔ)飼料，購自北京興隆動物廠。

該試驗已通過北京農(nóng)學(xué)院動物福利與倫理審查，編號為BUA2020112。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株腸道分布研究的分組處理方法 大鼠在進(jìn)行7 d適應(yīng)后進(jìn)行隨機(jī)分組，一次灌胃組36只，連續(xù)灌胃組22只。

一次灌胃組：該組每只大鼠進(jìn)行一次灌胃2.5×109CFU動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞，選取0.17、0.5、1、2、3、6、9、12、18、24、36和48 h進(jìn)行處死，3個平行，取胃、回腸、結(jié)腸和直腸4個部位的腸道內(nèi)容物，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液。每個樣品取2份200 μL腸道內(nèi)容物懸濁液，1份直接進(jìn)行DNA提取，另1份經(jīng)疊氮溴化丙錠處理后進(jìn)行DNA提取。提取后的DNA樣品-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

連續(xù)灌胃組：該組每只大鼠進(jìn)行連續(xù)7 d灌胃動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞2.5×109CFU。在灌胃結(jié)束后0、1、2、3、5、7、9、11、13和14 d取一部分大鼠糞便，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液，每個樣品取2份200 μL腸道內(nèi)容物懸濁液，1份直接進(jìn)行DNA提取，另1份經(jīng)70 μg/mL疊氮溴化丙錠暗處理5 min，功率500 W、距樣品15 cm的光處理4 min，進(jìn)行DNA提取，提取后的基因組-20 ℃?zhèn)溆?；另一部分在灌胃結(jié)束后7 d和14 d，取盲腸和結(jié)腸2個部位的腸道內(nèi)容物，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液，每個樣品取2份200 μL腸道內(nèi)容物懸濁液，1份直接進(jìn)行DNA提取，另1份經(jīng)疊氮溴化丙錠處理后進(jìn)行DNA提??；提取后的DNA樣品-20 ℃?zhèn)溆?，連續(xù)灌胃后14 d結(jié)束試驗。

腸道內(nèi)容物基因組DNA樣品的提取。取200 μL懸濁液，加入0.3 g直徑0.1 mm玻璃珠，300 μL Tris-SDS溶液(250 mL的200 mmol/L Tris-HCl，80 mmol/L EDTA緩沖液；pH 9.0，50 mL 10% SDS，混勻)，500 μL Tris飽和酚，上下顛倒混勻；使用球磨機(jī)劇烈震蕩30 s破碎菌細(xì)胞，16 000 r/min 4 ℃離心5 min；吸取400 μL上清于2 mL新離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)；輕輕混勻后16 000 r/min 4 ℃離心5 min；吸取300 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入30 μL濃度為3 mol/L乙酸鈉(pH值5.2)溶液和360 μL異丙醇，輕輕混勻后16 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清，加入70%乙醇500 μL，16 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清，溫室干燥30 min；加入pH值8.0的100 μL TE，5 μL RNase，混勻后37 ℃放置10 min，提取后的腸道內(nèi)容物DNA樣品-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

腸道中動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞、總菌細(xì)胞定量檢測。將凍存?zhèn)溆玫腄NA樣品，進(jìn)行定量PCR檢測，重復(fù)3次。正向引物CGCTCAAGCACTGCAATCAC，反向引物GATTGCTCGG GCGATTTGTG，引物20 bp；引物Tm值：正向引物57.5 ℃，反向引物57.6 ℃，GC含量為55%，擴(kuò)增片段大小為197 bp。定量PCR反應(yīng)體系20 μL：DNA模板1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，貨號RR820A，TAKARA)10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL。定量PCR的反應(yīng)程序：預(yù)變熱反應(yīng)95 ℃，5 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃，30 s；57.6 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40個循環(huán)。保守延伸反應(yīng)72 ℃，3 min。

1.3.2 菌株緩解便秘效果研究的分組處理方法 小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、模型組、活菌細(xì)胞組、死菌細(xì)胞組，各個組分成2個平行小組，每小組包括小鼠6只，共計48只，小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

對照組和模型組每只小鼠每天灌胃生理鹽水1 mL，活菌細(xì)胞組每只小鼠每天灌胃動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞2.5×109CFU，死菌細(xì)胞組每只小鼠每天灌胃動物雙歧桿菌A12死菌細(xì)胞2.5×109個。

1.3.3 小鼠排便試驗 灌胃動物雙歧桿菌A12的小鼠7 d后，各組小鼠禁吃飼料但不禁水16 h。模型組、活菌細(xì)胞組、死菌細(xì)胞組小鼠灌胃10 mg/kg復(fù)方地芬諾酯懸液(常州康普藥業(yè)有限公司)，對照組灌胃蒸餾水。

給予藥物復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，對照組和模型組每只小鼠灌胃0.1 mL的墨汁(100 g的阿拉伯樹膠，加入800 mL的蒸餾水，煮沸，待溶液透明后加入50 g活性炭粉，煮沸2～3次，冷卻后定容到1 000 mL，放在4 ℃冰箱中保存，用前搖勻[8-9])，動物雙歧桿菌A12菌細(xì)胞懸液與墨汁等體積混合，活菌細(xì)胞組、死菌細(xì)胞組的每只小鼠灌胃含動物雙歧桿菌A12的墨汁0.1 mL，重新開始正常飲水進(jìn)食。

從給小鼠灌胃墨汁開始，立即將它們轉(zhuǎn)移到新的代謝籠中，以模型組最后一只小鼠的排出首粒黑便的時間為終止，記錄各組每只小鼠的排出首粒黑便時間。并記錄5 h內(nèi)的排黑便粒數(shù)、黑便質(zhì)量。收集的糞便要立即進(jìn)行含水量的測定，105 ℃烘干5 h至質(zhì)量恒定，按照(1)式測定糞便的含水率[10]。

糞便含水率(%)=[1-(烘干后的質(zhì)量/烘干前的質(zhì)量)]×100%

(1)

1.3.4 小腸推進(jìn)試驗 小腸有3種運(yùn)動方式：蠕動、張力收縮運(yùn)動和分節(jié)運(yùn)動，以蠕動方式推動腸內(nèi)容物移動為主要方式。灌胃復(fù)方地芬諾酯，建立小鼠小腸蠕動的抑制模型后，再用墨汁為標(biāo)記物，觀察動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠腸道蠕動的影響，做小腸推進(jìn)試驗。

灌胃動物雙歧桿菌A12的小鼠14 d后，各組小鼠禁飼料但不禁水16 h。模型組、活菌細(xì)胞組、死菌細(xì)胞組小鼠灌胃10 mg/kg復(fù)方地芬諾酯懸液，對照組灌胃蒸餾水。

給復(fù)方地芬諾酯30 min后，對照組和模型組小鼠灌胃墨汁0.1 mL/kg；動物雙歧桿菌A12菌懸液與墨汁等體積混合，活菌細(xì)胞組、死菌細(xì)胞組的小鼠灌胃含動物雙歧桿菌A12的墨汁0.1 mL/kg。25 min后利用脫頸椎法使小鼠死亡，解剖腹腔分離出腸系膜，取從幽門到回盲部的腸管，將小腸拉成直線，平鋪在刻度尺上即為腸管總長度(cm)，從幽門開始量至墨汁推進(jìn)前沿為墨汁推進(jìn)長度(cm)，記錄每個小鼠的數(shù)據(jù)并計算墨汁推進(jìn)距離占小腸總長的百分比，即為墨汁推進(jìn)率，按式(2)計算[11]。

墨汁推進(jìn)率(%)=(墨汁推進(jìn)長度/小腸總長度)×100%

(2)

2 結(jié) 果

2.1 一次灌胃組動物雙歧桿菌A12的胃腸道分布情況

采用不同時間點對大鼠進(jìn)行處死處理，提取其胃、回腸、結(jié)腸、直腸4個胃腸道部位腸道內(nèi)容物的DNA，結(jié)合定量PCR進(jìn)行菌細(xì)胞數(shù)的檢測，以時間為橫坐標(biāo)，定量PCR檢測菌細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制分布規(guī)律曲線(圖1)。

胃中，動物雙歧桿菌A12總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)隨時間的增加而減少，0.17 h總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，分別為108.78個/g腸道內(nèi)容物和108.48CFU/g腸道內(nèi)容物，存活率達(dá)到50.1%，3 h之后活菌細(xì)胞數(shù)快速下降到檢測限以下，9 h總菌細(xì)胞數(shù)已經(jīng)低于檢測限。

回腸中，動物雙歧桿菌A12菌細(xì)胞攝入10 min后即可到達(dá)，總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)均隨時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0.5 h時總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，分別為108.48個/g腸道內(nèi)容物和107.18CFU/g腸道內(nèi)容物，存活率約為5.0%，3 h后迅速下降，9 h時活菌細(xì)胞數(shù)低于檢測限，24 h時總菌細(xì)胞數(shù)低于檢測限。

結(jié)腸中，3 h時可以檢測到動物雙歧桿菌A12但未檢測到活菌細(xì)胞，表明菌細(xì)胞攝入后至多3 h，便可以到達(dá)結(jié)腸部位，隨后總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，6 h總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，分別為108.08個/g腸道內(nèi)容物和107.58CFU/g腸道內(nèi)容物，存活率31.6%，明顯高于回腸部分；36 h后結(jié)腸中的總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)均低于檢測限。

直腸中，3 h可以檢測到動物雙歧桿菌A12總菌細(xì)胞，但未檢測到活菌細(xì)胞，表明菌細(xì)胞攝入后至多3 h，便可以到達(dá)直腸部位，總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但與結(jié)腸不同的是，直腸部位是在攝入菌細(xì)胞12 h后，總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)才達(dá)到最大值，分別為107.48個/g腸道內(nèi)容物和106.88CFU/g腸道內(nèi)容物，比結(jié)腸的峰值到來時間推遲9 h，同時表明大鼠攝入的動物雙歧桿菌A12，主要在9 h時排出體外，此時菌細(xì)胞的存活率為25.1%，但可以在體內(nèi)保留36 h左右，此時菌細(xì)胞的存活率為63.1%，48 h后總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)低于檢測限。

2.2 連續(xù)灌胃組動物雙歧桿菌A12的保留與排空情況

采用通過給大鼠連續(xù)7 d灌服2.5×109CFU的動物雙歧桿菌A12菌細(xì)胞，灌服結(jié)束后收集大鼠糞便進(jìn)行DNA提取，并結(jié)合定量PCR進(jìn)行總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)的檢測，以時間為橫坐標(biāo)，定量PCR檢測總菌細(xì)胞數(shù)對數(shù)值及活菌細(xì)胞數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制分布曲線，結(jié)果如圖2。

連續(xù)7 d灌服2.5×109CFU動物雙歧桿菌A12的大鼠，灌胃結(jié)束(0天)活菌細(xì)胞為106.68CFU/g腸道內(nèi)容物，灌胃結(jié)束后1 d，即24 h，總菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到107.08個/g腸道內(nèi)容物，活菌細(xì)胞106.40CFU/g腸道內(nèi)容物，均分別顯著高于一次灌胃結(jié)束24 h的總菌細(xì)胞數(shù)(105.75個/g腸道內(nèi)容物)和活菌細(xì)胞數(shù)(105.50CFU/g腸道內(nèi)容物)；灌胃結(jié)束2 d，即48 h，總菌細(xì)胞數(shù)106.02個/g腸道內(nèi)容物，活菌細(xì)胞數(shù)105.32CFU/g腸道內(nèi)容物，均分別顯著高于一次灌胃結(jié)束48 h的總菌細(xì)胞數(shù)和活菌細(xì)胞數(shù)(低于檢測限)。灌胃后3 d已經(jīng)檢測不到活菌細(xì)胞存在，總菌細(xì)胞數(shù)105.86個/g腸道內(nèi)容物，灌胃結(jié)束后第7天，總菌細(xì)胞數(shù)仍可檢出為105.51個/g腸道內(nèi)容物；第9天，動物雙歧桿菌A12總菌細(xì)胞數(shù)低于檢測限，表明動物雙歧桿菌A12連續(xù)攝入7 d后，可在體內(nèi)至少保留7 d。

2.3 連續(xù)灌胃組動物雙歧桿菌A12在盲腸與結(jié)腸的定殖情況

連續(xù)7 d攝入動物雙歧桿菌A12結(jié)束后，為進(jìn)一步檢測其在體內(nèi)定殖情況，收集灌服結(jié)束后7 d和14 d的盲腸和結(jié)腸腸道內(nèi)容物進(jìn)行DNA提取，結(jié)合定量PCR進(jìn)行總菌細(xì)胞數(shù)及活菌細(xì)胞數(shù)的檢測，結(jié)果見表1。

表1 動物雙歧桿菌A12在大鼠盲腸與結(jié)腸中的保留

在灌胃結(jié)束后7 d，盲腸中檢測到105.98個/g腸道內(nèi)容物的動物雙歧桿菌A12總菌細(xì)胞，但未檢測到活菌細(xì)胞；結(jié)腸中檢測到105.48個/g腸道內(nèi)容物的動物雙歧桿菌A12總菌細(xì)胞，未檢測到活菌細(xì)胞；14 d后大鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)均未檢測到動物雙歧桿菌A12菌細(xì)胞。

2.4 動物雙歧桿菌A12對小鼠便秘的緩解效果

為了進(jìn)一步探討可以活著通過胃腸道的動物雙歧桿菌A12在腸道中發(fā)揮的作用，設(shè)計小鼠便秘模型，評價該菌株對便秘小鼠的糞便質(zhì)量，排便時間即腸道蠕動功能的影響。

動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠排便指標(biāo)的影響見表2。在糞便含水率方面各組的數(shù)據(jù)并沒有太大的變化，說明動物雙歧桿菌A12在緩解大便干燥方面并沒有顯著的功效；模型組的小鼠排出首粒黑便的時間、5 h內(nèi)排出黑便的顆粒數(shù)、糞便的質(zhì)量等指標(biāo)均與對照組比較有極顯著差異(P<0.01)，這說明便秘小鼠模型造模成功；活菌細(xì)胞組的小鼠排出首粒黑便時間、5 h內(nèi)排便量、排便數(shù)目與模型組相較達(dá)到極顯著的水平(P<0.01)，而死菌細(xì)胞組對便秘小鼠排便指標(biāo)的影響與模型組相較無顯著差異(P>0.05)。

表2 動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠排便指標(biāo)的影響Tab.2 Effect of B. animalis A12 on defecation index of constipated mice

模型組與對照組的墨汁推進(jìn)率有極顯著差異(P<0.01)，表明小鼠造模成功；活菌細(xì)胞組與模型組的墨汁推進(jìn)率之間有極顯著差異(P<0.01)，表明動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞具有促進(jìn)小腸蠕動和內(nèi)容物的排出，緩解便秘的功效；而灌胃動物雙歧桿菌A12死菌細(xì)胞的小鼠的墨汁推進(jìn)率與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，表明動物雙歧桿菌A12的死菌細(xì)胞并無促進(jìn)便秘小鼠腸道蠕動的作用(表3)。

表3 便秘小鼠的墨汁推進(jìn)率Tab.3 Promoting rate of ink in mice with constipation

3 討 論

用PCR法對大鼠腸道環(huán)境中動物雙歧桿菌進(jìn)行檢測，為了進(jìn)一步驗證該方法所用引物特異性，在灌胃前對大鼠腸道內(nèi)容物DNA進(jìn)行PCR檢測，均未檢測到動物雙歧桿菌A12的特征產(chǎn)物條帶，說明選用的大鼠腸道內(nèi)無內(nèi)源性動物雙歧桿菌可檢出，表明疊氮溴化丙錠與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合方法結(jié)合特異引物可用于檢測動物雙歧桿菌A12在大鼠腸道內(nèi)的動態(tài)分布情況。在小腸中十二指腸和空腸中內(nèi)容物極少，回腸內(nèi)容物含量相對較多，便于收集樣品檢測；在大腸中，盲腸的環(huán)境極為復(fù)雜，而且研究多為檢測菌群豐度，在研究過程中不具有指導(dǎo)意義，結(jié)腸中的環(huán)境較適宜菌細(xì)胞的生存，因此，對結(jié)腸的研究較多[12]，菌株在此部位的分布具有較高價值；直腸是檢測菌細(xì)胞保留與排空的重要部位，也是研究菌株定殖的主要部位[12-13]；這是本研究選取胃、回腸、結(jié)腸和直腸4個部位作為研究菌株胃腸道分布規(guī)律的基礎(chǔ)。

羅佳和金鋒[14]及COLLADO等[15]通過給健康志愿者口服動物雙歧桿菌DN-173010，連續(xù)28 d，每天服用1.4×109CFU/mL，并利用雙歧桿菌屬特異探針結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)每7 d對動物雙歧桿菌DN-173010菌細(xì)胞進(jìn)行檢測，得出菌細(xì)胞隨著口服時間的延長而增多，從最初的108.52CFU/g濕糞便的排出量，28 d后可達(dá)1010.41CFU/g濕糞便，口服結(jié)束后28 d動物雙歧桿DN-173010的菌細(xì)胞恢復(fù)至初始水平，但是該研究并未針對動物雙歧桿菌DN-173010菌株進(jìn)行特異性檢測，也未分辨該菌株的死菌細(xì)胞、活菌細(xì)胞，同時無法說明菌株在體內(nèi)的保留時間。另外，喬雪微[12]的研究表明長雙歧桿菌BBMN68在被連續(xù)攝入7 d后，停止攝入的第3天就不能在大鼠的糞便中檢測到長雙歧桿菌BBMN68菌株，至于是否在體內(nèi)保留，未開展研究。而本研究表明動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞至少可在體內(nèi)保留2 d，總菌細(xì)胞保留7 d以上。

不同種屬的雙歧桿菌主要是通過增加糞便中乙酸的含量，對于便秘均有緩解作用[10]，但這種便秘的緩解效果具有菌株特異性。乙酸是結(jié)腸發(fā)酵的主要產(chǎn)物。增加腸內(nèi)乙酸量可導(dǎo)致腸道滲透壓增加，腸內(nèi)容物含水量增加，從而刺激腸壁，增加腸蠕動[16]，死菌細(xì)胞不具有分泌乙酸的能力，因此本研究中的動物雙歧桿菌A12死菌細(xì)胞組對于促進(jìn)腸道蠕動沒有顯著效果。本研究中，動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞可以把便秘小鼠的小腸蠕動速率提高41.1%，與王琳琳[10]研究發(fā)現(xiàn)的動物雙歧桿菌CCFM 625可以把便秘小鼠的小腸蠕動速率提高25%相比具有菌株優(yōu)勢，同時，對照組沒有顯著差異，可以保持正常水平。

每只大鼠一次灌服動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞2.5×109CFU，胃的排空時間為6 h、回腸排空時間為24 h、結(jié)腸的排空時間為36 h、直腸排空時間為48 h。每只大鼠連續(xù)7 d灌服動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞2.5×109CFU，動物雙歧桿菌A12活菌細(xì)胞至少可在體內(nèi)保留2 d，定位在結(jié)腸和直腸，總菌細(xì)胞保留7 d以上。此外，動物雙歧桿菌A12的活菌細(xì)胞可以顯著提高小鼠的排便數(shù)量和質(zhì)量，提高含水量，縮短排便時間，促進(jìn)小腸蠕動，緩解其便秘表征。