BasS/BasR雙組分系統(tǒng)調(diào)控大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性研究

陳欣玥，金君華，張紅星，謝遠紅

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實驗室/ 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206)

乳酸菌細菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的蛋白或多肽，近年來乳酸菌細菌素以其穩(wěn)定無毒、不改變食品風味的特點常作為一種新型生物防腐劑應(yīng)用于食品加工與貯藏中，且有望成為抗生素的替代品[1]。細菌素按照化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子量大小可分為四類：分子量為5 kD的羊毛硫抗生素[2]；分子量小于10 kD的小分子熱穩(wěn)定肽，分為IIa、IIb、IIc這3個亞類[2]；分子量大于10 kD的熱敏感大分子蛋白[2]；復(fù)合型乳酸菌細菌素[2]。目前，在所有乳酸菌細菌素中，針對IIa類乳酸菌細菌素的研究較為深入[3]：IIa類乳酸菌細菌素是由乳酸菌代謝產(chǎn)生的、具有革蘭氏陽性單增李斯特菌強抑菌活性的、未修飾的小分子熱穩(wěn)定肽[3-4]。IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的作用方式主要是與敏感菌的細胞膜相互作用，引起敏感菌細胞膜的改變，使細菌發(fā)生崩解死亡[5]。革蘭氏陰性菌對于IIa類細菌素敏感性的調(diào)控機制與作用靶點目前研究尚未定論。

雙組分系統(tǒng)是存在于細菌細胞內(nèi)、協(xié)助細菌感知適應(yīng)不同環(huán)境變化的最普遍機制之一[6]。一個典型的雙組分系統(tǒng)是由一個位于內(nèi)膜上的傳感器激酶(組氨酸激酶)和一個細胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子組成[7-9]。大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統(tǒng)是大腸桿菌中的鋅鐵感應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，其中BasS(又稱PmrB)為傳感器激酶蛋白，BasR(又稱PmrA)為反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，在大腸桿菌外界環(huán)境改變時，通過磷酸化激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，改善細胞狀態(tài)，維持細胞穩(wěn)定[10-13]。已有研究表明，BasS/BasR雙組分系統(tǒng)通過修飾細胞膜來增加大腸桿菌的抗藥性，如對多粘菌素B的抗性[14]。BasS/BasR雙組分系統(tǒng)調(diào)控大腸桿菌對植物乳桿菌素抗性的研究較少。

在前期研究中，本課題組從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中分離鑒定得到1株植物乳桿菌BM-1。植物乳桿菌BM-1能夠代謝產(chǎn)生一種IIa類乳酸菌細菌素即植物乳桿菌素BM-1。該細菌素對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等都有一定的抑菌作用[12]。

本研究旨在篩選大腸桿菌(Escherichiacoli)中與植物乳桿菌素BM-1直接作用的大腸桿菌細胞膜上的互作蛋白，并分析其影響大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074是2016年10月購于大腸桿菌突變體庫KEIO collection，詳情見表1。

表1 菌株特性及來源Tab.1 Strain features and source

植物乳桿菌BM-1產(chǎn)植物乳桿菌素BM-1，由北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室保藏。

MRS肉湯，MRS瓊脂培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基[13]，制備培養(yǎng)基使用的試劑均為國產(chǎn)分析純級；硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、EDTA、尿素和脫氧膽酸鈉，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；3500Da透析袋，購于北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；Bacteria RNA Extraction Kit、HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗儀器

DL-CJ-1NDII超凈臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LHS-100CH恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；DYY-6DCP-32B型恒流電泳儀，北京六一儀器廠；GL-21M臺式冷凍離心機，上海滬湘儀離心機儀器有限公司。

BT2202S電子天平(Starorius)，StepOnePlus Real-Time PCR System(ABI)，磁力架(蘇州海貍生物科技有限公司)，MiniBeadBeater-16(BioSpec)，翻轉(zhuǎn)架(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)，電導(dǎo)儀(Mettler)，紫外分光光度計(上海佑科儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌素BM-1的制備 采用pH介導(dǎo)細胞吸附-解吸技術(shù)與陽離子交換色譜法純化植物乳桿菌素BM-1[12]。將植物乳桿菌素BM-1培養(yǎng)液加熱后調(diào)節(jié)pH至pH值6.0，于室溫條件下攪拌30 min，使植物乳桿菌素BM-1吸附到細胞表面；離心收集細胞，洗滌沉淀后，使用100 mmol/L NaCl重懸，調(diào)節(jié)pH至pH值2.0，4 ℃條件下攪拌12 h，離心后上清4 ℃條件下使用ddH2O透析24 h，冷凍干燥后得到第一步純化后的植物乳桿菌素BM-1。使用檸檬酸鈉緩沖液重懸第一步純化后的植物乳桿菌素BM-1；使用SP-Sepharose快速流動陽離子交換色譜柱(長度200 mm，內(nèi)徑10 mm)將重懸后的植物乳桿菌素BM-1上樣，使用pH值3.1的檸檬酸鈉緩沖液進行洗脫，直到檢測不到280 nm處吸光值；使用0.1～0.5 mol/L NaCl線性梯度洗脫植物乳桿菌素BM-1，收集活性成分，使用ddH2O透析后得到純化的植物乳桿菌素BM-1，用牛津杯測定此時細菌素效價[12]。

1.3.2 大腸桿菌與植物乳桿菌素BM-1互作蛋白的篩選 以1×102CFU/mL接種量將野生型大腸桿菌K12接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD值為0.5。菌液中加入植物乳桿菌素BM-1至最終效價為512 AU/mL，37 ℃培養(yǎng)2 h；以不添加植物乳桿菌素BM-1的大腸桿菌為對照。12 000 r/min將培養(yǎng)好的菌液離心10 min，棄上清，用1 mL PBS(pH值7.4)復(fù)溶離心后的菌液沉淀，加入0.3 g玻璃珠(100 mm)，使用Beadbeater破碎菌體2次。靜置破碎后的菌液，小心吸取上清，12 000 r/min離心上清10 min，向沉淀中加入9倍體積包涵體裂解液，室溫下靜置30 min，12 000 r/min離心5 min，使用包涵體溶解液溶解沉淀，得到菌體蛋白。取490 μL菌體蛋白溶液，加入10 μL偶聯(lián)植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體的磁珠[15]，4 ℃旋轉(zhuǎn)反應(yīng)過夜。反應(yīng)后磁珠用1×PBS緩沖液和0.1%脫氧膽酸鈉洗滌2次，蛋白電泳檢測洗脫液。

蛋白洗脫液使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行蛋白鑒定：首先使用Orbitrap Fusion Lumos與Easy-nLC 1000液相色譜系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)，用0.1%甲酸水溶液溶解標記樣品，將溶解后肽段裝載至C18反相柱(預(yù)柱填料粒徑3 μm，孔徑120?，2 cm×100 μm ID；分析柱填料粒徑1.9 μm，孔徑120?，15 cm×150 μm ID)進行預(yù)分離，流速600 nL/min，洗脫60 min；使用Lumos3質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)，采用DDA模式(data-dependent acquisition mode)進行分析。一級質(zhì)譜使用Orbitrap進行全掃描，掃描范圍350～1 550 m/z，掃描分辨率120 000，AGC targets為4e5 ions，Max injection time為50 ms；二級質(zhì)譜采集通過32%的高能碰撞解離(HCD)對母離子進行碎裂，碎片離子在Orbitrap中進行檢測，F(xiàn)irst Mass為100，分辨率15 000，AGC targets為5e4 ions，Max injection time為22 ms，動態(tài)排除30 s；最后采用Proteome Discoverer2.1軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，得到蛋白定性和定量信息。

1.3.3 BasS/BasR雙組分系統(tǒng)缺失大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性分析 取生長至對數(shù)期的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073和突變型大腸桿菌JW4074，將這3種菌液分別接種至5 mL的LB培養(yǎng)基中，使其終濃度為1×102CFU/mL，加入植物乳桿菌素BM-1，使其效價為512 AU/mL；以不添加植物乳桿菌素BM-1的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073和突變型大腸桿菌JW4074為對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h進行1次菌落計數(shù)，最終繪制出植物乳桿菌素BM-1作用下3株大腸桿菌的活菌數(shù)曲線[16]。

1.3.4 植物乳桿菌素BM-1對缺失BasS/BasR雙組分系統(tǒng)大腸桿菌電導(dǎo)率的檢測 將接種量是1×102CFU/mL的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074分別接種到5 mL培養(yǎng)基中，并加入植物乳桿菌素BM-1使其最終效價為512 AU/mL，37 ℃培養(yǎng)14 h，每隔2 h測1次電導(dǎo)率；以不加植物乳桿菌素BM-1的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074為對照。

1.3.5 BasS/BasR雙組分系統(tǒng)缺失對大腸桿菌基因表達的檢測 將接種量是1×102CFU/mL的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074分別接種到5 mL培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。提取細菌總RNA進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為50 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循環(huán)，使用引物如表2所示。將野生型大腸桿菌K12作為內(nèi)參因子，使用2-△△Ct法計算突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074中各個基因的相對表達量。

表2 引物序列Tab.2 Sequence of primers

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，并對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)。使用Origin 2019程序繪制圖表。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌與植物乳桿菌素BM-1互作蛋白的篩選

植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體進行免疫共沉淀后洗脫蛋白電泳如圖1所示。第1泳道內(nèi)經(jīng)植物乳桿菌素BM-1處理后的大腸桿菌在20 kD處出現(xiàn)明顯條帶，第2泳道的大腸桿菌同樣在20 kD處出現(xiàn)較暗的背景蛋白條帶。經(jīng)蛋白質(zhì)譜對比去除大腸桿菌的背景蛋白后，篩選得到一個豐度指標0.233，分子量為25.015 kD，含有222個氨基酸且可信度高的大腸桿菌菌體蛋白，質(zhì)譜鑒定其為大腸桿菌DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄雙調(diào)節(jié)因子BasR(P30843)。

2.2 BasS/BasR雙組分系統(tǒng)缺失大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性影響

使用活菌計數(shù)法進一步分析BasR蛋白所在BasS/BasR雙組分蛋白基因突變對大腸桿菌植物乳桿菌素BM-1敏感性的影響，結(jié)果如圖2所示。野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌在不添加植物乳桿菌素BM-1單獨培養(yǎng)時，均呈現(xiàn)典型的生長規(guī)律。野生型大腸桿菌K12在單獨培養(yǎng)6 h時，活菌數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，進入指數(shù)增長期，并在12 h達到穩(wěn)定期，此時活菌數(shù)為9.38 lgCFU/mL，此后24 h內(nèi)活菌數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074在不添加植物乳桿菌素BM-1時，生長趨勢總體與野生型大腸桿菌K12相似，但進入指數(shù)期較野生型大腸桿菌K12更為提前，4 h活菌數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，進入指數(shù)增長期，且在指數(shù)增長期增長速度更快。在此之后的8 h和10 h處突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的活菌數(shù)達到穩(wěn)定期，最終活菌數(shù)分別為7.24 lgCFU/mL和7.27 lgCFU/mL。

添加植物乳桿菌素BM-1培養(yǎng)后，野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌活菌數(shù)在24 h內(nèi)的變化趨勢與單獨培養(yǎng)相比產(chǎn)生明顯變化。添加植物乳桿菌素BM-1后，野生型大腸桿菌K12在前14 h培養(yǎng)時間內(nèi)活菌數(shù)增加明顯被抑制，未出現(xiàn)變化，第16小時活菌數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，進入指數(shù)期，第24小時活菌數(shù)達到6.33 lgCFU/mL。相比之下，添加植物乳桿菌素BM-1培養(yǎng)后，突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的生長在前14 h被抑制，第16小時活菌數(shù)進入指數(shù)增長期，但增長速度較同時期相同培養(yǎng)條件的野生型大腸桿菌K12更為緩慢，且相對于單獨培養(yǎng)時，添加植物乳桿菌素BM-1后突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這2株突變型大腸桿菌的指數(shù)增長期被延后，到達指數(shù)期的時間與添加植物乳桿菌BM-1培養(yǎng)的野生型大腸桿菌K12相同。第24小時突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的活菌數(shù)分別為4.67 lgCFU/mL與4.91 lgCFU/mL，顯著低于野生型大腸桿菌K12第24小時的活菌數(shù)。說明植物乳桿菌素BM-1對突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的生長造成的影響更大，即相對于野生型大腸桿菌K12，BasS/BasR雙組分系統(tǒng)缺失的突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074對植物乳桿菌素BM-1更敏感。

2.3 植物乳桿菌素BM-1對缺失BasS/BasR雙組分系統(tǒng)大腸桿菌電導(dǎo)率的影響

野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌在添加與不添加植物乳桿菌素BM-1條件下培養(yǎng)的電導(dǎo)率在14 h內(nèi)均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，但添加植物乳桿菌素BM-1培養(yǎng)的大腸桿菌與單獨培養(yǎng)的大腸桿菌的電導(dǎo)率變化趨勢相似，差異均不顯著，未產(chǎn)生明顯對比(P>0.05)，見圖3。雖然這3株大腸桿菌均對植物乳桿菌素BM-1表現(xiàn)出不同程度的敏感性，但植物乳桿菌素BM-1的添加并未造成大腸桿菌細胞膜的破裂和內(nèi)容物外泄。

2.4 BasS/BasR雙組分系統(tǒng)缺失對大腸桿菌基因表達的影響

提取野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074的總RNA(圖4)，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖5所示。突變型大腸桿菌JW4073的dgka基因與野生型大腸桿菌K12相比顯著下調(diào)了71%，mlaf基因下調(diào)了37%。突變型大腸桿菌JW4074與野生型大腸桿菌K12相比，dgka基因顯著下調(diào)了93%，mlaf基因顯著下調(diào)了71%，eco基因顯著下調(diào)了95%。在不表達BasS/BasR雙組分系統(tǒng)后，突變型大腸桿菌中細胞膜結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)蛋白表達被降低。

3 討 論

細菌素來源廣泛，種類繁多，且低毒性與不易產(chǎn)生耐藥性的特點引起人們廣泛關(guān)注，但目前針對IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的抑菌機理以及作用靶點研究還不夠深入[17-18]。本試驗通過免疫共沉淀篩選得到與IIa類細菌素植物乳桿菌素BM-1產(chǎn)生作用的大腸桿菌菌體蛋白BasR，其屬于BasS/BasR雙組分系統(tǒng)，該雙組分系統(tǒng)的基因突變導(dǎo)致大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性加強，證明BasS/BasR雙組分系統(tǒng)能夠調(diào)控大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性。

以往的研究表明，對于革蘭氏陰性菌，IIa類細菌素對其作用方式是通過與菌體細胞表面產(chǎn)生靜電作用從而使細菌素吸附在細胞膜表面，穿過脂多糖，進入細胞質(zhì)膜，造成孔洞，從而破碎菌體細胞，使內(nèi)容物外泄，達到殺菌作用[19-20]。本研究中電導(dǎo)率結(jié)果顯示大腸桿菌細胞膜并未破裂，說明植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用方式與已有的IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的作用方式不同，即添加植物乳桿菌素BM-1后，大腸桿菌細胞膜并未破裂。結(jié)合大腸桿菌生長曲線結(jié)果，推斷植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用方式為抑制細菌生長而不是通過破碎細胞導(dǎo)致菌體死亡。

本研究中發(fā)現(xiàn)BasS/BasR雙組分系統(tǒng)參與大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性調(diào)控。BasS/BasR雙組分系統(tǒng)感應(yīng)到外界環(huán)境變化被激活后，參與細胞膜結(jié)構(gòu)、膜轉(zhuǎn)運與結(jié)合的基因會被該雙組分系統(tǒng)明顯上調(diào)，使菌體在不利環(huán)境下依然保持穩(wěn)定[21]。大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統(tǒng)的調(diào)控機制與沙門氏菌中PmrA/PmrB雙組分系統(tǒng)相類似[22]，組氨酸蛋白激酶BasS感知到細菌外界環(huán)境變化后，由HATPase結(jié)構(gòu)域供能，BasS蛋白hisKA結(jié)構(gòu)域的組氨酸被磷酸化，將信號傳遞給反應(yīng)調(diào)節(jié)因子BasR蛋白，從而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[23-24]。相關(guān)研究表明，腸桿菌科細菌BasS/BasR雙組分系統(tǒng)可通過誘導(dǎo)下游靶基因轉(zhuǎn)錄的方式，修飾脂質(zhì)A，參與細胞膜磷脂雙分子層的修飾，來達到抵抗多粘菌素B的作用[25]。BasS/BasR雙組分系統(tǒng)調(diào)控下游靶基因，包括參與膜結(jié)構(gòu)形成與修飾的dgka、調(diào)節(jié)膜功能的mlaf、參與細胞應(yīng)激反應(yīng)功能的eco等，這些基因的表達均可以穩(wěn)定細胞膜形態(tài)[24]。相關(guān)試驗已經(jīng)證實在添加植物乳桿菌素BM-1的條件下，野生型大腸桿菌K12可通過加速肽聚糖合成，調(diào)節(jié)細胞膜表達，維持細胞超微結(jié)構(gòu)的方式來抵御來自細菌素的傷害[26]。本試驗結(jié)合已有研究結(jié)果，將大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統(tǒng)與大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1抗性相關(guān)聯(lián)，通過RT-qPCR驗證大腸桿菌中BasS/BasR雙組分系統(tǒng)蛋白基因突變，Dgka、MlaF、Eco這3個蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著變化，證明該雙組分系統(tǒng)的缺失確實降低大腸桿菌中dgka，mlaf和eco等基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，從而弱化大腸桿菌細胞膜強度，降低大腸桿菌細胞膜剛性，提高大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性。

植物乳桿菌素BM-1針對野生型大腸桿菌K12的作用體現(xiàn)在抑制細菌生長，并非導(dǎo)致菌體破裂死亡，而大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統(tǒng)的缺失會導(dǎo)致大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性提高，從而有效增強植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的抑制效果。