多效唑?qū)蠲吠寥牢⑸锛皟?nèi)生群落結(jié)構(gòu)的影響

任海英，周慧敏,3，戚行江，鄭錫良，俞浙萍，張淑文，王震鑠

多效唑?qū)蠲吠寥牢⑸锛皟?nèi)生群落結(jié)構(gòu)的影響

1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，北京 100193；3長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434023

【】多效唑常用在楊梅上用來催化花芽分化，過量施用會使樹勢衰弱、葉片卷曲皺縮。研究過量多效唑?qū)蠲犯鶉梁透硗恋耐寥烂富钚砸约皸蠲窐潴w微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為合理使用多效唑提供理論指導(dǎo)。1年生‘東魁’楊梅嫁接苗種植在經(jīng)150、300和600 mg?kg-1多效唑處理的酸性紅壤，不施用多效唑為對照。檢測根圍土、根表土、根、枝和葉中多效唑的積累量，測定土壤酶活性，利用Illumina MiSeq高通量測序研究多效唑?qū)Ω鶉?、根表土、根、枝和葉中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。楊梅葉片積累多效唑量最多，過氧化氫酶和磷酸酶活性顯著降低，蔗糖酶活性顯著提高。高濃度多效唑處理下，根圍土的細菌多樣性和豐富度明顯降低，真菌多樣性和豐富度明顯升高，而根表土內(nèi)的細菌多樣性和豐富度明顯升高、真菌多樣性和豐富度明顯降低，根內(nèi)細菌、枝內(nèi)真菌的多樣性和豐富度均明顯降低。在細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析中，施用多效唑后，明顯降低楊梅根以及根圍、根表土壤中酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門以及重要的生防類菌芽孢桿菌綱的相對豐度，增加根圍土壤和枝條樣品中伯克霍爾德菌屬的相對豐度；而在真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析中，施用多效唑后，明顯提高根圍土壤和根表土壤的子囊菌門以及枝條葉片中外擔(dān)菌綱的相對豐度，明顯降低根圍土壤、根表土壤和根中擔(dān)子菌門、傘菌綱以及枝條和葉片中青霉屬的相對豐度。土壤施用多效唑后，楊梅樹體葉片殘留量最多，土壤過氧化氫酶、磷酸酶、蔗糖酶活性顯著變化，根圍土、根表土、根、枝和葉中細菌、真菌豐富度和多樣性發(fā)生顯著變化。本研究結(jié)果可為合理施用多效唑和評價多效唑?qū)麍@土壤和楊梅樹體生態(tài)系統(tǒng)的影響提供科學(xué)依據(jù)，有利于指導(dǎo)多效唑的科學(xué)施用。

楊梅；多效唑；土壤酶活性；微生物群落

0 引言

【研究意義】楊梅（Sieb Zucc.）果實甜酸適口，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值高，全國栽培面積約33.4萬hm2, 年產(chǎn)量約95萬t，經(jīng)濟效益顯著[1-2]?！畺|魁’品種果個大，商品性好，栽培面積達到70%以上，但是該品種生長旺盛、花芽分化困難，常施用多效唑來控梢促花芽，產(chǎn)業(yè)上常常出現(xiàn)多效唑施用過量導(dǎo)致楊梅葉間縮短、葉片卷曲、樹體衰弱，甚至引起樹體早衰死亡[3-4]。開發(fā)出有效恢復(fù)早衰楊梅樹勢的技術(shù)，成為產(chǎn)業(yè)的迫切需求?！厩叭搜芯窟M展】多效唑[Paclobutrazol, （2RS, 3RS）-1-（4-氯苯基）-4,4-二甲基-2-（1H-1,2,4-三唑-1-基）戊烷-3-醇，PP333]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，常用于促進開花和坐果、調(diào)節(jié)植物生長，如矮化芍藥[5]和小麥[6]，提高玉米[7]、茶樹種子和油料產(chǎn)量[8]，降低番茄株高、提高光合速率、縮短果實的成熟時間[9-10]，也常用于楊梅的促花[11]。多效唑在土壤殘留期較長，殘留的多效唑會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡[12-13]，對楊梅的根際菌根有傷害作用，同時降低菌絲的侵染能力[14]，使用過量使楊梅葉片細胞緊縮、變小，葉片皺縮，秋梢抽發(fā)減少，極易出現(xiàn)早衰現(xiàn)象[3]。微生物是土壤的重要組分，其結(jié)構(gòu)和多樣性影響著土壤肥力、植物生長發(fā)育[15-16]、有機物分解和污染物降解等[17]，重構(gòu)土壤菌群結(jié)構(gòu)是提高土壤肥力的重要措施[18-19]。內(nèi)生菌是廣泛存在于植物各組織器官中以宿主植物代謝物為營養(yǎng)物質(zhì)的一類微生物[20-21]，促進植物吸收養(yǎng)分、生長加快、增強抗性[22-24]，重金屬污染和病原菌侵染等均可以改變內(nèi)生菌群的群落結(jié)構(gòu)[25-26]。但是多效唑?qū)蠲窐潴w內(nèi)生菌群和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的作用未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】多效唑的推薦噴施濃度為300—750 mg·L-1，適宜噴施時期為7月上旬至9月下旬[11]，但是在產(chǎn)業(yè)上農(nóng)民往往土壤施用，而且是多次施用，連續(xù)土壤施用300—400 mg·kg-1的PP333會導(dǎo)致楊梅葉片和土壤中PP333的殘留和積累，使楊梅葉片畸形、樹體早衰及死亡。明確多效唑?qū)蠲犯鶉透硗寥酪约案?、枝和葉的微生物群落影響將有助于開發(fā)恢復(fù)楊梅樹勢的技術(shù)措施?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘東魁’楊梅為試材，進行不同濃度多效唑處理，對多效唑在楊梅樹體根、枝、葉和土壤內(nèi)的殘留、土壤酶活性以及施用多效唑前后楊梅土壤及樹體微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況進行研究，為開發(fā)恢復(fù)早衰楊梅樹勢的技術(shù)，指導(dǎo)多效唑科學(xué)施用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院進行。

1.1 試驗材料

試驗所用的楊梅苗于2018年4月種植在玻璃溫室內(nèi)。選擇體積為30 cm×30 cm的無紡布袋裝滿黃泥土（取自仙居荒山，未種植過楊梅，未使用過任何農(nóng)業(yè)投入品），根據(jù)楊梅出現(xiàn)葉片卷縮、葉間縮短的樹體根圍土壤多效唑殘留量檢測[4]以及土壤施用多效唑引起楊梅樹體危害的劑量報道[3]，配置多效唑濃度為0（P0）、150（P150）、300（P300）和600（P600）mg?kg-1的黃泥土，選擇長勢一致的1年生‘東魁’楊梅嫁接苗小心種植入袋內(nèi)，每個處理梯度種植15棵苗，置入玻璃溫室內(nèi)，平均溫度25℃，以無多效唑的黃泥土種植的楊梅為對照，按常規(guī)方式管理，不施用其他肥料和農(nóng)藥。

1.2 取樣方法

種植6個月后，最高濃度處理P600的葉片出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，采集距離主莖10 cm位置的土壤用于多效唑殘留和土壤酶活性測定，采集根圍土、根表土及葉片、枝條、樹根等樣品，迅速放入液氮中冷凍后置于-80℃冰箱備用。距離頂端3片嫩葉以下的成熟葉片和對應(yīng)位置的枝干用來檢測多效唑的積累量。每3個葉片、3根枝條或者樹根為1次重復(fù)，每個處理均設(shè)6次重復(fù)。

在樹冠滴水線位置0—20 cm土層內(nèi)挖取直徑0.5—1.0 cm的細根，用手輕輕抖動收集的樣品即為根圍土壤，把須根放入50 mL PBS中150 r/min搖床搖30 min，然后1 000 r/min離心5 min，收集土壤沉淀，晾干過40目篩網(wǎng)即為根表土[27]，每盆土算1個重復(fù)，每個處理均設(shè)6次重復(fù)。

1.3 多效唑殘留量檢測

對采集的楊梅枝條、葉片、根、根圍土和根表土中的多效唑殘留提取和檢測參照趙鋒等[28]的方法。

根圍和根表土壤的多效唑提取方法：準(zhǔn)確稱取10.0 g土壤樣品，加入5 mL去離子水和20 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min，4 500 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)入盛有5 g NaCl的具塞量筒中，余下的土樣按上述提取方法第2次提取。將2次提取液合并轉(zhuǎn)入盛有5 g NaCl的具塞量筒中，渦旋2 min，靜止30 min，用移液管抽取上清液20 mL轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2.5 mL正己烷定容，0.45 μm有機膜過濾于進樣小瓶中保存，待測。

楊梅根、枝、葉多效唑提取方法：準(zhǔn)確稱取5.0 g已磨碎的勻質(zhì)樣品，加入乙腈溶液10 mL，渦旋，加入NaCl 1.5 g靜置10 min，渦旋后8 000 r/min，10 min離心，取上清液備用。然后用5 mL甲醇和5 mL水預(yù)處理固相萃取柱，取上清液過柱，再用5 mL水和5 mL 5%甲醇淋洗萃取柱，棄去淋洗液，抽干小柱，5 mL甲醇洗脫小柱，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜，待測。

多效唑含量采用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC-MS-MS）測定。標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取多效唑標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量0.0050 g（精確至0.0001 g），甲醇溶液溶解定容稀釋至濃度分別為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 μg?mL-1，過0.22 μm濾膜，待用。稱取多效唑標(biāo)準(zhǔn)品，少量甲醇溶液溶解，用水分別稀釋到50、100、150、200、250和300 μg?mL-1，每個濃度的溶液200 mL。色譜條件：流速1 mL?min-1；溫度40℃；波長220 nm；進樣量20 μL；色譜柱為XBridge C18色譜柱；流動相是乙腈﹕水=1﹕1（體積比）。

1.4 土壤酶活性檢測

土壤過氧化氫酶活性采用微量滴定法測定[29]，土壤磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定[30]，土壤蔗糖酶采用銅試劑定量法[31]，纖維素酶活性測定用3,5-二硝基水楊酸比色法[32]。每個樣品技術(shù)重復(fù)6次，取平均值。

1.5 土壤基因組測序

P0和P600處理的根圍土壤（分別記為BS0、BSP）、根表（分別記為SF0、SFP）和根（分別記為R0、RP）、枝（分別記為T0、TP）、葉（分別記為L0、LP）樣品的基因組測序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司執(zhí)行。采用DNA抽提試劑盒（DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit）提取樣本基因組DNA，以稀釋后的基因組DNA為模板，使用Tks Gflex DNA Polymerase高保真酶（Takara，大連）進行PCR，使用帶條形碼（Barcode）的特異引物343F-5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和798R-5'-AGGGTATCTAATCCT-3'PCR擴增細菌多樣性對應(yīng)區(qū)域16SrRNA V3-V4區(qū)[33]，ITS1F-5'-CTTGG TCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2-5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3' 擴增真菌ITS多樣性對應(yīng)區(qū)域ITS1和ITS2[34]，使用Qubit dsDNA Assay Kit定量后，PCR產(chǎn)物等量混樣，利用Illumina MiSeqPE300平臺對PCR產(chǎn)物進行測序。采用Illumina Miseq對微生物多樣性測序分析，使用Vsearch軟件按照97%的相似度進行OTU分類，采用RDP Classifier Naive Bayesian對代表序列與數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本研究中Alpha多樣性指數(shù)采用Mothur軟件進行計算，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。Chao1指數(shù)反應(yīng)群落的豐富度，而Shannon指數(shù)反應(yīng)群落的多樣性。Beta多樣性分析利用R3.5.1語言進行，即主成分析（principal component analysis，PCA）。微生物群落結(jié)構(gòu)柱形圖使用QIIME軟件繪制，用以呈現(xiàn)不同分類水平土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和豐度分布[35]。采用Excel 2010作數(shù)據(jù)初步處理，用SPSS17.0軟件進行顯著性檢驗，采用Duncan’s新復(fù)極差法（α=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 多效唑在土壤及楊梅樹體內(nèi)的積累

P600處理的葉片內(nèi)積累的多效唑量最大，達到7.83 mg?kg-1。P300處理的葉片以及P600和P300處理的枝條內(nèi)含量次之，且三者沒有顯著性差異，含量在2.59—3.97 mg?kg-1，P150處理的葉片和枝條以及所有處理的根和土壤內(nèi)積累量很少，與對照沒有顯著性差異（表1）。說明楊梅樹體中葉片最容易積累多效唑，枝條次之，根最少。

表1 不同多效唑用量在土壤及楊梅樹體內(nèi)的殘留量

同列數(shù)據(jù)上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同

The different lowercase letters in the same column show significant difference at the level of 0.05. The same as below

2.2 土壤酶活性

過氧化氫酶廣泛存在于土壤和生物體內(nèi)，能有效防止土壤代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫對生物體造成的毒害。P150處理的土壤過氧化氫酶活性相比對照沒有顯著性差異，但是P300和P600的過氧化氫酶活性顯著降低，分別降低8.89%和14.44%（表2）。說明高濃度多效唑處理后楊梅樹體受到的過氧化氫毒害可能加重。

土壤中磷酸酶可參與土壤有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷，積累的磷酸酶對土壤磷素的有效性具有重要作用。P150處理的土壤磷酸酶活性相比對照沒有顯著性差異，但是P300和P600的磷酸酶活性顯著降低，分別降低76.89%和63.08%（表2）。說明高濃度多效唑可能抑制楊梅對磷肥的吸收。

蔗糖酶是一種可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能夠被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，為土壤生物體提供充分能源，其活性反映了土壤有機碳累積與分解轉(zhuǎn)化的規(guī)律。P300和P600處理的土壤蔗糖酶活性相比對照顯著升高，升高幅度在59.80%—80.50%。說明高濃度的多效唑增強了楊梅對有機碳的分解轉(zhuǎn)化能力。

纖維素酶催化土壤中的短物殘體水解成纖維二糖，纖維二糖再分解成葡萄糖，是碳循環(huán)中的一個重要酶。施用多效唑土壤的纖維素酶活性相比對照差異顯著，P300處理的酶活性比對照顯著升高26.80%，而P150和P600處理的土壤酶活性相比對照顯著降低，分別降低了36.59%和48.78%（表2）。說明多效唑濃度對纖維素酶活性影響沒有明顯的規(guī)律。

表2 施用多效唑后楊梅土壤內(nèi)活性酶的活性

2.3 Alpha多樣性分析

豐富度指數(shù)Chao1以及群落多樣性指數(shù)Shannon數(shù)值越高，表明豐富度及多樣性越高。多效唑施用后，根圍土和根內(nèi)的細菌Chao1、Shannon指數(shù)均明顯下降，但是根表土的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)卻明顯升高。而枝條和葉片內(nèi)的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均較小，且施用前后沒有明顯差異或者差異較?。ū?）。根圍土和葉片內(nèi)的真菌Chao1指數(shù)以及根圍土和根內(nèi)的真菌Shannon指數(shù)明顯升高，而根表土、根、枝的真菌Chao1指數(shù)以及根表土、枝的真菌Shannon指數(shù)明顯降低（表3）。說明楊梅施用多效唑后，根圍土的細菌多樣性和豐富度明顯降低，真菌多樣性和豐富度明顯升高，而根表土內(nèi)的細菌多樣性和豐富度明顯升高、真菌多樣性和豐富度明顯降低，根內(nèi)的細菌多樣性和豐富度以及枝內(nèi)的真菌多樣性和豐富度均明顯降低，枝條和葉片內(nèi)細菌相對數(shù)量較少。

2.4 Bata多樣性分析

通過分析不同樣品的OTU組成可以反映樣品間的差異和距離，如樣品群落結(jié)構(gòu)越相似，反映在PCA圖中的距離越近（圖1）。由圖1-A可知，多效唑處理過的根圍土（BSP）、根表土（SFP）、根（RP）與對照根圍土（BS0）、根表土（SF0）、根（R0）之間距離較遠，而多效唑處理過的枝（TP）和葉（LP）與對照的枝（T0）葉（L0）之間距離較近，細菌提取的2個主成分的貢獻率分別為34.36%、24.47%，楊梅根（R0和RP）主成分1軸的負軸、正軸均有分布，根表土（SF0和SFP）及根圍土（BS0和BSP）均分布在主成分1軸的負軸。表明在施用多效唑后，根圍土、根表土以及根中的細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，而枝和葉中細菌群落結(jié)構(gòu)相似。

表3 細菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)

#和*分別表示多效唑處理與對照差異顯著（＜0.05）

#and * indicate that the Chao1 and Shannon in paclobutrazol treated trees was significantly different with control trees (＜0.05), respectively

BS：根圍土壤；SF：根表土壤；R：根；T：枝條；L：葉 BS: Bulk soil; SF: Root surface soil; R: Root; T: Twig; L: Leaves

由圖1-B可知，多效唑處理過的根圍土（BSP）、根表土（SFP）、枝（TP）與對照根圍土（BS0）、根表土（SF0）、枝（T0）之間距離較遠，顯示明顯的離分，而多效唑處理過的根（RP）和葉（LP）與對照根（R0）、葉（L0）之間距離較近；真菌提取的2個主成分的貢獻率分別為25.81%、22.86%，根圍土（BS0和RP）及根表土（SF0和SFP）均分布在主成分1軸的正軸，葉片（L0和LP）及枝條（T0和TP）均分布在主成分1軸的負軸?？梢姸嘈н蛱幚砗?，根圍土、根表土及楊梅樹體枝條的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變。

2.5 細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.5.1 門水平群落結(jié)構(gòu)分析 細菌門分類水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖2-A所示，在楊梅根以及根表、根圍土壤中，優(yōu)勢菌門（相對豐度＞2%）主要有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）。與對照相比，施用多效唑后，楊梅根以及根表、根圍土壤變形菌門的相對豐度都分別提高了1.69倍、57.55%、50.16%；酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門的相對豐度都有所降低，降低了8.76%—99.32%，其中根、根表土中的厚壁菌門顯著降低了99.32%、89.08%；而擬桿菌門在楊梅根中的相對豐度降低了9.54%，在根圍、根表土壤中分別提高了1.45倍、3.96倍?？梢娛┯枚嘈н蛎黠@提高了楊梅根以及根圍、根表土壤中變形菌門的相對豐度，而酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門的相對豐度都明顯降低；在根圍、根表土壤中擬桿菌門的相對豐度有明顯升高，而在楊梅根中與之相反。

葉片和枝條中由于細菌數(shù)量很少，而枝條中優(yōu)勢菌門（相對豐度＞2%）有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門。施用多效唑后，枝條中變形菌門相對豐度降低了77.78%，酸桿菌門未檢測到，而放線菌門的相對豐度提高了1.22倍。可見多效唑處理后，枝條中變形菌門的相對豐度有明顯降低，放線菌門相對豐度明顯升高。

2.5.2 綱水平群落結(jié)構(gòu)分析 細菌綱分類水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖2-B所示，在楊梅根以及根圍、根表土壤中，優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）主要有-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteriia）、放線菌綱（Actinobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）。與對照相比，施用多效唑后，楊梅根以及根表、根圍土壤中-變形菌綱和-變形菌綱提高了19.25%—259.34%，其中根部γ-變形菌綱增加最多；酸桿菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱、纖線桿菌綱降低了4.66%— 99.44%，其中根部芽孢桿菌綱降低最多；而擬桿菌綱在根表、根圍土壤中分別增加了1.4倍和4.55倍，在根中降低了15.74%。因此，施用多效唑后明顯提高了楊梅根以及根表、根圍土壤中-變形菌綱和-變形菌綱的相對豐度，而重要的生防類菌芽孢桿菌綱在根中顯著減少。

枝條中優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）有-變形菌綱、-變形菌綱、酸桿菌綱和放線菌綱。未施用多效唑時，枝條中-變形菌綱、酸桿菌綱的相對豐度分別為3.33%、3.33%；施用多效唑后，枝條中-變形菌綱、酸桿菌綱均未檢測到，而γ-變形菌綱的相對豐度明顯降低了72.22%，放線菌綱增加了11.11%。說明施用多效唑可以明顯降低枝條中-變形菌綱、酸桿菌綱和-變形菌綱的相對豐度，增加了放線菌綱相對豐度。

2.5.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)分析 在楊梅根中，優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）主要為乳球菌屬（）、節(jié)桿菌屬（）、柄桿菌屬（）。與對照相比，施用多效唑后，在根表土壤中優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）主要為乳球菌屬、，與對照相比，施用多效唑后根表土壤中乳球菌屬和屬的相對豐度都分別降低了89.18%、37.71%。在根圍土壤中，優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）主要為乳球菌屬和伯克霍爾德菌屬（），與對照相比，施用多效唑處理后根圍土壤中伯克霍爾德菌屬的相對豐度明顯增加了2.99倍，而乳球菌屬降低了72.32%，其相對豐度明顯降低；楊梅根中乳球菌屬、節(jié)桿菌屬、柄桿菌屬的相對豐度分別降低了99.96%、99.97%、99.05%。枝條中優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）為伯克霍爾德菌屬和諾卡氏菌屬（），施用多效唑后，伯克霍爾德菌屬的相對豐度相比對照增加了11.11%，而諾卡氏菌屬未檢測到（圖2-C）。由此可知，施用多效唑后在根圍土壤和枝條樣品中可以明顯增加伯克霍爾德菌屬的相對豐度，乳球菌屬和諾卡氏菌的相對豐度分別在根圍土壤和枝條樣品中明顯降低。

圖2 細菌門（A）綱（B）屬（C）水平相對豐度分布圖

2.6 真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.6.1 門水平群落結(jié)構(gòu)分析 在真菌門分類水平中（圖3-A），優(yōu)勢菌門（相對豐度＞2%）僅有子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。與對照相比，施用多效唑處理后，根表、根圍土壤中子囊菌門的相對豐度分別提高了26.74%、6.64倍，可見根圍土壤中子囊菌門的相對豐度有明顯的提高；而根表、根圍土壤中的擔(dān)子菌門分別降低了83.55%、63.73%，根中子囊菌門、擔(dān)子菌門的相對豐度分別降低了8.09%、97.78%。葉片和枝條中子囊菌門的相對豐度分別降低了7.74%、63.74%，擔(dān)子菌門分別提高了9.67%和16倍。說明施用多效唑后，根圍土壤和根表土壤的子囊菌門相對含量升高，但是根、枝和葉相對含量降低；根圍土壤、根表土壤和根內(nèi)擔(dān)子菌門的相對含量顯著降低，而枝和葉的擔(dān)子菌門相對含量顯著升高。

圖3 真菌門（A）綱（B）屬（C）水平相對豐度分布圖

2.6.2 綱水平群落結(jié)構(gòu)分析 在真菌綱分類水平中（圖3-B），根圍土中優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）僅有傘菌綱（Agaricomycetes），與對照相比，多效唑處理后其相對豐度明顯降低了68.17%。在根表土中優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）有糞殼菌綱（Sordariomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes），多效唑處理后，糞殼菌綱的相對豐度相比對照提高了96.28%，而傘菌綱、散囊菌綱、錘舌菌綱的相對豐度分別降低了81.56%、97.93%、96.19%。在楊梅根中，優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）有糞殼菌綱、傘菌綱，與對照相比，多效唑處理后楊梅根中糞殼菌綱、傘菌綱的相對豐度分別降低了16.49%、98.74%。在枝條中，優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）有糞殼菌綱、座囊菌綱（Dothideomycetes）、外擔(dān)菌綱（Exobasidiomycetes）、散囊菌綱，與對照相比，多效唑處理后糞殼菌綱、座囊菌綱、散囊菌綱的相對豐度都分別降低了99.60%、8.37%、99.54%，外擔(dān)菌綱的相對豐度提高了24.33倍。在葉片中，優(yōu)勢菌綱（相對豐度＞2%）有座囊菌綱、外擔(dān)菌綱，多效唑處理后，座囊菌綱的相對豐度相比對照降低了0.98%，而外擔(dān)菌綱的相對豐度提高了10.08%。總體來說，施用多效唑后，根圍土、根表土和根中的傘菌綱相對含量均明顯降低，而枝和葉中座囊菌綱相對含量顯著降低，外擔(dān)菌綱顯著升高。

2.6.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)分析 在真菌屬分類水平中（圖3-C），在根圍土中優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）有蛙糞霉屬（）、裸腳傘屬（s），與對照相比，多效唑處理后蛙糞霉屬、裸腳傘屬的相對豐度提高了36.49倍、29.62倍。在根表土中，優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）有，多效唑處理后，屬的相對豐度相比對照提高了176.85倍。楊梅根中優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）有，多效唑處理后，屬的相對豐度相比對照降低了63.57%。在枝條中，優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）有、平臍疣孢屬（）、青霉屬（）、球腔菌屬（）、枝孢屬（），與對照相比，多效唑處理后的、平臍疣孢屬相對豐度分別提高了24.46倍、51.11%，青霉屬、球腔菌屬、枝孢屬分別降低了99.53%、78.22%、99.30%，其相對豐度都有明顯的降低。葉片中的優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞2%）有、平臍疣孢屬、青霉屬、球腔菌屬、鐵艾酵母屬（），多效唑處理后，、球腔菌屬的相對豐度相比對照分別提高了20.04%、13.46%，平臍疣孢屬、青霉屬、鐵艾酵母屬的相對豐度都分別降低了17.05%、90.19%、42.07%。由此可知，多效唑的施用使根圍土、根表土和根內(nèi)的屬變化趨勢不一致，而枝和葉片條的相對含量顯著升高，青霉屬的相對含量顯著降低。

3 討論

多效唑抑制楊梅的營養(yǎng)生長，這與抑制馬鈴薯的生長[36]相一致。本研究結(jié)果顯示多效唑在楊梅根圍土、根表土以及根、枝、葉內(nèi)均有殘留，葉片內(nèi)殘留量最大，枝條次之，根內(nèi)積累量較少，與土壤內(nèi)的殘留量相當(dāng)，葉片內(nèi)高殘留量可能是引起葉片皺縮的主要原因。

土壤酶活性可以反映土壤質(zhì)量和養(yǎng)分狀況[37]。前人研究發(fā)現(xiàn)施用生物型肥料、微生物菌劑可顯著提高土壤中脲酶、蔗糖酶和磷酸酶的酶活性[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度多效唑處理的土壤磷酸酶活性相比對照顯著降低，這可能是因為多效唑?qū)α姿崦赶嚓P(guān)合成菌株具有抑制作用，說明多效唑可能抑制楊梅對磷肥的吸收，這與施用生物型肥料、微生物菌劑可顯著提高土壤中磷酸酶的酶活性結(jié)果相反[38-39]，施用生物型肥料和微生物菌劑可以改良多效唑施用過多的土壤。多效唑處理后的土壤蔗糖酶活性相比對照顯著升高，說明多效唑濃度大時增強了楊梅對有機碳的分解轉(zhuǎn)化能力，這與施用生物型肥料、微生物菌劑可顯著提高土壤中蔗糖酶活性相一致[38-39]。

多效唑使用濃度的不同會影響土壤菌群結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)[40]。本研究結(jié)果表明，施用多效唑后楊梅根圍土的細菌多樣性和豐富度明顯降低，真菌多樣性和豐富度明顯升高；而根表土內(nèi)的細菌多樣性和豐富度明顯升高，真菌多樣性和豐富度明顯降低，這可能是多效唑的施用影響了土壤中的菌群結(jié)構(gòu)，與前人研究結(jié)果相似。

植物的生長環(huán)境和細菌群落結(jié)構(gòu)相互影響，生物有機肥料施用后細菌群落結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢菌群大多都為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門等[18,41-42]。在細菌群落結(jié)構(gòu)組成分析中發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌門有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等，這與前人研究結(jié)果一致。楊梅根圍、根表土壤和根中的變形菌門相對豐度最高，且都在施用多效唑處理后有不同程度的增加。變形菌大多為革蘭氏陰性菌，其中許多細菌負責(zé)固氮，可增加土壤中的氮素營養(yǎng)，所以變形菌的增加可能促進植物生長[43]。而在楊梅葉片和枝條中，放線菌門的相對豐度明顯降低。放線菌可以抑制植物病害的發(fā)生，放線菌含量的降低可能會使病原菌更容易侵染植物[12]，這可能是楊梅施用多效唑后抗病性降低的原因之一。楊梅根以及根表、根圍土壤中的優(yōu)勢菌綱主要有-變形菌綱、-變形菌綱、酸桿菌綱，這與朱英波等[44]研究黑龍江大豆田土壤細菌中的優(yōu)勢類群有-變形菌綱、-變形菌綱及酸桿菌群等結(jié)果相一致。-變形菌綱屬于變形菌門的一個綱，是陸地土壤中的優(yōu)勢菌群[45]，-變形菌包括很多動植物病原菌，同時也存在很多抑制植物致病菌的有益菌[44]。本研究中施用多效唑后明顯提高了楊梅根中-變形菌綱的相對豐度，楊梅根中的-變形菌綱很可能是有害菌，需要進一步研究其生物學(xué)功能。很多芽孢桿菌屬、假單胞菌屬能抑制土傳病害，促進植物生長，施用多效唑?qū)е赂鶉?、根表土的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等種類顯著減少，這可能造成土壤中有害菌大量繁殖，對楊梅的生長不利，使樹體抗病性降低，與前人研究結(jié)果一致[46]。

植物生長環(huán)境和真菌群落結(jié)構(gòu)相互影響，子囊菌和擔(dān)子菌是土壤中重要的分解者，子囊菌門真菌大多數(shù)為腐生菌，多進行腐生或寄生，也包括多種病原菌和有害菌屬[47-48]。本研究中，多效唑處理明顯提高了根圍和根表土壤中子囊菌門的相對豐度，可能會引起楊梅病害的發(fā)生。優(yōu)勢菌綱主要有糞殼菌綱、傘菌綱、散囊菌綱、座囊菌綱等，這與木瓜、馬藺、葡萄、大豆、玉米[49]和黃土高原不同種植類型梯田之間[50]土壤真菌綱相似。多效唑的施用使根圍和根表土壤及楊梅根、枝、葉的真菌菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生了明顯的變化，明顯降低了葉片及枝條中青霉屬的相對豐度，有研究表明，青霉菌包含的菌株多數(shù)為致病菌[51]，所以多效唑的施用可能會減少由青霉菌引起的楊梅病害。多效唑的施用改變了楊梅根圍、根表土壤及樹體的核心菌群，其對楊梅的生長以及抗病功能的影響需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

施用多效唑后，梅葉片中積累多效唑含量最大，顯著降低了土壤中過氧化氫酶、磷酸酶活性，提高了蔗糖酶活性；提高了根表土的細菌多樣性，降低了根圍土和根的細菌多樣性，而根圍土真菌多樣性和豐富度明顯升高，根表土內(nèi)真菌多樣性和豐富度明顯降低，根內(nèi)生細菌多樣性、豐富度和枝內(nèi)生真菌多樣性及豐富度均明顯降低。在細菌群落結(jié)構(gòu)中，施用多效唑后，提高了楊梅根以及根圍、根表土壤中變形菌門的相對豐度，而放線菌門、厚壁菌門都明顯降低，枝條、葉片與之相反；明顯提高了楊梅根內(nèi)生-變形菌綱的相對豐度以及根圍土壤中伯克霍爾德菌屬的相對豐度。在真菌群落結(jié)構(gòu)中，施用多效唑后，根圍土中子囊菌門、枝條中擔(dān)子菌門、根表土中糞殼菌綱、枝條中外擔(dān)菌綱，根表土中的相對豐度均明顯提高，而根中的糞殼菌綱，根圍土中的傘菌綱，枝條中青霉屬以及都出現(xiàn)明顯降低。研究結(jié)果對評價多效唑?qū)ν寥兰皸蠲窐潴w微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響有重要的指導(dǎo)意義，有利于指導(dǎo)科學(xué)施用多效唑，為開發(fā)有效恢復(fù)多效唑過量施用引起的楊梅樹勢早衰技術(shù)提供了菌株和理論基礎(chǔ)。

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Effects of Paclobutrazol on Soil and Endophytic Microbial Community Structure of Bayberry

1Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021;2College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193;3College of Horticulture and Landscape Architecture, Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei

【】Paclobutrazol is commonly used to catalyze flower bud differentiation in bayberry, however, excessive application will weaken the vigor of the trees with curled and shrank leaves. The study focused on the influence of paclobutrazol overuse on the enzyme activities of the bulk and root surface soil as well as plant and soil microbial community structure of bayberry, which would provide the theoretical guidance for the rational use of paclobutrazol.【】The grafted seedlings of one-year-old bayberry cv. ‘Dongkui’ were planted in the acid red soil and treated with 150, 300 and 600 mg?kg-1paclobutrazol, and the control was treated with the same volume of water. The accumulation of paclobutrazol was measured in the bulk and root surface soil, as well as roots, twigs and leaves of bayberry. The influence of paclobutrazol on bayberry associated microbe was determined by examining the soil enzyme activities and the microbial community structure of bulk and root surface soil, roots, twigs and leaves by using Illumina MiSeq high-throughput sequencing. 【】The results showed that the most accumulation of paclobutrazol was in leaves, while the activities of catalase and phosphatase were significantly decreased, but the activities of invertase were significantly increased. The high concentration application of paclobutrazol significantly decreased diversity and richness of bacteria and increased the diversity and richness of fungi in bulk soil, which significantly increased the diversity and richness of bacteria and increased the diversity and richness fungi in surface root soil, while the diversity and richness of both root bacteria and branches fungi were significantly decreased. After the application of paclobutrazol, the relative abundance of Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Chloroflexi and important biocontrol bacteria Bacilli in bayberry root, root bulk and root surface soil were significantly reduced, and those ofin root bulk soil and twigs were increased in the bacterial community composition; the relative abundance of Ascomycota in root bulk soils and root surface soils, those of Exobasidiomycetes in twigs and leaves were significantly increased, and those of Basidiomycota and Agaricomycetes in root bulk soil, root surface soil and roots, andin twigs and leaves were significantly decreased in the analysis of fungal community composition. 【】The most residue was found in leaves of bayberry plant after soil application of paclobutrazol. The overuse of paclobutrazol caused a significant change in the activities of catalase, phosphatase and sucrase treated soils, as well as the richness and diversity of bacteria and fungi in the bulk and root surface soil, roots, branches and leaves of the bayberry trees. Overall, the results of this study not only gave an understanding on the influence of paclobutrazol on bayberry and orchard soil ecosystem, but also provided a theoretical basis for the rational application of paclobutrazol.

bayberry; paclobutrazol; soil enzyme activity; microbial community

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.016

2021-02-26；

2021-05-20

浙江省科技廳重點研發(fā)計劃（2019C02038）、浙江省重點研發(fā)計劃項目（2020C02001，2021C02009）

任海英，0571-86410266, renhy@zaas.ac.cn。通信作者王震鑠，E-mail：zhenswang@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）