棉花內(nèi)生細(xì)菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase對棉花枯萎病的防治作用及機理

周京龍，馮自力，魏鋒，趙麗紅，張亞林，周燚，馮鴻杰，朱荷琴

棉花內(nèi)生細(xì)菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase對棉花枯萎病的防治作用及機理

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽 455000

【】棉花枯萎?。‵usarium wilt）是棉花種植中較為嚴(yán)重的土傳病害之一，主要采用化學(xué)方法進(jìn)行防治，但對環(huán)境和人畜安全造成一定影響。生物防治因其專一性強、安全性高的特點，成為防治棉花枯萎病的重要途徑。本研究旨在獲得一株高效拮抗細(xì)菌，并明確其防治機理，為棉花枯萎病生物防治提供技術(shù)支持。前期獲得一株能夠破壞-1，4糖苷鍵的棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌（）YUPP-10，通過平板對峙培養(yǎng)、共培養(yǎng)法和懸滴法分別測試其對棉花枯萎病菌（尖鐮孢，）菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響；利用YUPP-10菌液浸種處理，研究其對棉花生物量的影響；以尖鐮孢菌土為基質(zhì)種植棉花，生長1周后，用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的YUPP-10制成不同濃度（分別為1×108、1×107和1×106cfu/mL）的生防菌劑灌根處理棉苗，于溫室中進(jìn)行棉花枯萎病的防治效果研究；通過Fosmid文庫篩選到了YUPP-10關(guān)鍵抑菌物質(zhì)為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase，EC 2.4.1.19），研究其對尖鐮孢菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響；利用擬南芥花序侵染法將其轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，研究轉(zhuǎn)基因擬南芥對枯萎病的抗性，以及在病原脅迫下部分防御基因的轉(zhuǎn)錄。YUPP-10菌株發(fā)酵液對尖鐮孢菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，隨著發(fā)酵液濃度的升高，對尖鐮孢產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的抑制率越高，最高抑制率分別為98.41%和51.65%。低濃度的YUPP-10菌液能促進(jìn)棉花種子發(fā)芽、出苗和地上部分的生長。YUPP-10發(fā)酵液灌根處理后，棉苗的病情指數(shù)和病株率顯著降低，其中，1×107cfu/mL的YUPP-10發(fā)酵液對棉花枯萎病的防治效果最高，達(dá)到45.11%。YUPP-10菌株的關(guān)鍵抑菌物質(zhì)CGTase能夠水解羧甲基纖維素和葡甘聚糖，表明其具有破壞-1,4糖苷鍵的能力，進(jìn)而檢測了其對尖鐮孢的抑制效果，結(jié)果表明CGTase對尖鐮孢的菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的最高抑制率分別達(dá)到62.63%和30.83%。轉(zhuǎn)的擬南芥提高了對枯萎病的抗性，過表達(dá)的擬南芥在病原脅迫下部分防御基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。蠟狀芽孢桿菌YUPP-10菌株能抑制尖鐮孢的生長、促進(jìn)棉花部分生物量指標(biāo)的增長并控制枯萎病的危害，CGTase能夠抑制尖鐮孢的生長，轉(zhuǎn)擬南芥對枯萎病的抗性增強。

蠟狀芽孢桿菌；棉花枯萎病；尖鐮孢萎蔫?；筒【?；環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；防治效果

0 引言

【研究意義】纖維是全球重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，棉花纖維占據(jù)了纖維產(chǎn)量的35%，中國作為世界纖維產(chǎn)量及消費大國，棉花產(chǎn)業(yè)對國民經(jīng)濟(jì)具有重要意義[1]。然而，在棉花的整個生育期受到各種生物和非生物脅迫。由尖鐮孢萎蔫?；筒【╢. sp.）引起的土傳維管束枯萎?。‵usarium wilt）能造成棉花毀滅性損失。棉花枯萎病的常規(guī)防控措施包括選育抗性品種、耕作管理以及化學(xué)殺真菌劑的應(yīng)用。但是，棉花新品種的培育較為費時，而且由于病原體的變異性和適應(yīng)寄主抗性的能力，常會導(dǎo)致喪失抗性[2]。化學(xué)藥劑重復(fù)使用，會使病原體產(chǎn)生抗藥性，且對某些有益生物產(chǎn)生負(fù)面影響[3]。應(yīng)用有益微生物作為生物防治劑是控制植物病害的重要方法，也是減少化學(xué)農(nóng)藥影響環(huán)境的有效手段。【前人研究進(jìn)展】生物防治被認(rèn)為是控制植物病害的一種可持續(xù)的防治方法。關(guān)于棉花枯萎病的生物防治，主要通過真菌和細(xì)菌對病原菌的拮抗作用或（和）誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性實現(xiàn)。張海軍等[4]研究表明，拮抗真菌綠色木霉（）GY20能夠使尖鐮孢原生質(zhì)體濃縮和菌絲斷裂，盆栽試驗證明GY20對棉花枯萎病具有防治效果。內(nèi)生細(xì)菌作為拮抗菌的重要來源，在植物病害的防治上已有諸多成功案例，其中，芽孢桿菌是研究最多的拮抗細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌（）[5]、解淀粉芽孢桿菌（）[6]和蠟狀芽孢桿菌（）[7]等。關(guān)于拮抗細(xì)菌防治棉花枯萎病也有較多報道，從健康海島棉植株分離的短小芽孢桿菌（）KX-33能夠促進(jìn)棉苗生長，抑制枯萎病菌，可作為種衣劑防治棉花枯萎病[8-9]；解淀粉芽孢桿菌SN06能夠顯著降低棉花枯萎病的病情指數(shù)，防治效果高達(dá)65.2%；壯觀鏈霉菌（）SC11可在棉花根際土壤和根部長期定殖，在大田中對棉花枯萎病的防治效果達(dá)到40%左右[10]。蠟狀芽孢桿菌作為生防菌可用于棉花立枯病、茄子黃萎病、鷹嘴豆灰霉病和番茄灰霉病等的防治[11-14]，但用于棉花枯萎病防治的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c】前期，利用葡甘聚糖作為培養(yǎng)基定向篩選出一株降解-1,4糖苷鍵的棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10，其對棉花黃萎病具有較好的防治效果[15]，鑒于YUPP-10菌株具有降解-1,4糖苷鍵的能力，推測其對真菌病害具有廣譜防治效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究YUPP-10發(fā)酵產(chǎn)物對尖鐮孢菌絲生長、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)以及浸種處理對棉花生物量的影響，制成的生防菌劑對棉花枯萎病的防治效果。進(jìn)一步鑒定其關(guān)鍵抑菌物質(zhì)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC 2.4.1.19）對尖鐮孢的抑制作用，為棉花枯萎病的生物防治提供新資源。

1 材料與方法

試驗于2016—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所完成。

1.1 供試菌株及植物材料

棉花枯萎病病原菌分離自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所大田（河南省安陽市），保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害實驗室（以下簡稱本實驗室）；棉花內(nèi)生細(xì)菌蠟狀芽孢桿菌YUPP-10、CGTase原核表達(dá)菌株p、轉(zhuǎn)化擬南芥（）菌株p均來自本實驗室；試驗選用感病棉花品種冀棉11號和耐病品種魯棉研21號。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5g·L-1，NaCl 10 g·L-1，瓊脂14 g·L-1。加蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調(diào)pH 7.0—7.2，分裝后高壓滅菌，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

Czapek培養(yǎng)基：NaNO32 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，K2HPO41.31 g·L-1。加蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調(diào)pH 7.0，分裝后高壓滅菌。

PDA培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯煮沸過濾液，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂14 g·L-1。加入蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調(diào)pH 7.0—7.2，分裝后高壓滅菌。

玉米蛭石培養(yǎng)基：玉米糝﹕蛭石=1﹕1（質(zhì)量比），適量開水?dāng)嚢?，分裝于克氏瓶中高壓滅菌。

1.3 YUPP-10對尖鐮孢的拮抗作用

1.3.1 對峙培養(yǎng)法測定YUPP-10對尖鐮孢的影響 將YUPP-10菌株在LB固體平板上活化，選取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為菌種，以1%接種量接種到200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，獲得YUPP-10培養(yǎng)液備用。在PDA平板培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，呈三角狀對稱在PDA平板中打孔，每孔距離中心20 mm，在其中兩孔接入100 μL YUPP-10培養(yǎng)液，剩余一個孔加入100 μL LB液體培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)3次，25℃恒溫培養(yǎng)觀察抑菌情況，7 d后測量抑菌帶寬。

1.3.2 懸滴法[16]測定YUPP-10代謝產(chǎn)物對尖鐮孢孢子萌發(fā)的影響 將YUPP-10培養(yǎng)液（制備方法同1.3.1）在4℃，5 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的濾芯過濾獲得無菌上清液，備用。在Czapek培養(yǎng)基中接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，在25℃，180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用4層醫(yī)用無菌紗布過濾，濾液即為尖鐮孢孢子懸浮液，利用血球計數(shù)板計算孢子濃度。取無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液100 μL，與等量的尖鐮孢孢子懸浮液（2×103cfu/mL，Czapek培養(yǎng)液）均勻混合，取20 μL懸滴于載玻片上，在25℃下保濕培養(yǎng)，5 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，以LB培養(yǎng)液與尖鐮孢孢子懸浮液的等體積混合液為對照，每處理重復(fù)3次。

1.3.3 混合培養(yǎng)法測定YUPP-10代謝產(chǎn)物對尖鐮孢產(chǎn)孢量的影響 取YUPP-10無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液（制備方法同1.3.2）500 μL，與等體積的尖鐮孢孢子懸浮液（制備方法同1.3.2）均勻混合，在25℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鏡檢，計算孢子濃度。

1.4 YUPP-10浸種處理對棉花種子發(fā)芽的影響

YUPP-10培養(yǎng)液的制備方法同 1.3.1。50 mL培養(yǎng)液置于50 mL離心管中，4℃，5 000 r/min離心收集菌體，用30 mL無菌水重懸菌體，4℃，5 000 r/min離心，重復(fù)洗滌3次，去除LB培養(yǎng)基。為了避免菌體沉淀，將洗滌后收集的菌體懸浮在等體積5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，備用。取脫絨飽滿的魯棉研21號種子，75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3次，4%次氯酸鈉消毒4 min，無菌水洗滌3次。取50粒消毒后的種子在3種濃度（原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液）的YUPP-10羧甲基纖維素鈉中浸種12 h，無菌水多次洗滌種子后置于培養(yǎng)皿中25℃保濕培養(yǎng)，2 d后檢測發(fā)芽率及芽長，以5%的羧甲基纖維素鈉溶液浸種處理為對照，每處理重復(fù)3次。

1.5 YUPP-10浸種處理對棉花出苗及生長的影響

種子消毒處理同1.4，取適量粒消毒后的種子在YUPP-10羧甲基纖維素鈉懸浮液（制備方法同1.4，OD600=0.2）浸種處理12 h，無菌水多次洗滌種子后，播種在滅菌的蛭石中，在溫度為23—30℃，相對濕度在60%以上的日光溫室中培養(yǎng)7 d后檢測出苗情況，15 d后檢測根長、莖長和棉苗鮮重，以羧甲基纖維素鈉浸種處理為對照，每處理重復(fù)3次。

1.6 YUPP-10對棉花枯萎病的防治效果

將PDA平板活化的尖鐮孢接種在Czapek培養(yǎng)基中，在25℃、160 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)4 d，將尖鐮孢接種在滅菌的蛭石玉米培養(yǎng)基中，25℃下培養(yǎng)，直至菌絲長滿克氏瓶，取出培養(yǎng)物，在陰涼處風(fēng)干，備用。取脫絨飽滿的冀棉11號種子，75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3次，4%次氯酸鈉消毒4 min，無菌水洗滌3次，在室溫下無菌水浸種處理24 h，棉苗培育方法參照朱荷琴等[17]使用的蛭石沙子無底紙缽定量蘸菌液法，其中將制備好的尖鐮孢蛭石玉米培養(yǎng)物以0.6%（質(zhì)量比）的接種量混到蛭石沙土基質(zhì)中。播種后7 d，用200 mL不同濃度的YUPP-10培養(yǎng)液（分別為1×108、1×107和1×106cfu/mL）進(jìn)行灌根處理，每6個營養(yǎng)缽為一個處理，每處理重復(fù)4次，以LB液體培養(yǎng)基處理為對照。棉苗在日光溫室中培養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20—30℃，土壤相對濕度在60%以上，光照良好。在棉苗生長25 d左右觀察發(fā)病情況，調(diào)查病情指數(shù)，統(tǒng)計防治效果。棉花苗期枯萎病的分級按國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

病情指數(shù)=[ Σ（病害級數(shù)×各病級株數(shù)）/（調(diào)查的總株數(shù)×4）] ×100；防治效果（%）=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)/對照病情指數(shù)）] ×100。

1.7 CGTase的水解活性

制作羧甲基纖維素（1.2 g·L-1）和葡甘聚糖（1.2 g·L-1）固體平板，對稱放置4個牛津杯，其中兩孔加0.48 mg·mL-1的CGTase蛋白溶液100 μL，剩余兩孔加100 μL蛋白緩沖液（50 mmol·L-1Tris HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 7.5）作為對照，置于37℃暗培養(yǎng)12 h，移除牛津杯，在培養(yǎng)皿中添加10 ml碘-碘化鉀（0.2%﹕2%）染液，5 min后棄掉染液，透明圈即表示蛋白對兩種物質(zhì)的水解能力。

1.8 CGTase的抑菌活性

在PDA平板培養(yǎng)基中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，對稱在PDA平板上打兩孔，25℃恒溫培養(yǎng)3 d后，在其中一孔接入0.48 mg·mL-1CGTase蛋白溶液50 μL，另一孔加入50 μL蛋白緩沖液作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)觀察抑菌情況，2 d后測量抑菌帶寬。取0.12、0.24和0.48 mg·mL-1CGTase作為處理，蛋白緩沖液作為對照進(jìn)行產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)試驗，其他處理同方法 1.3.2和1.3.3。

1.9 轉(zhuǎn)CGTase擬南芥的抗病能力

為明確CGTase是否可作為利用基因工程進(jìn)行抗病育種的資源，利用Floral dip法[18]進(jìn)行擬南芥的轉(zhuǎn)化，使擬南芥能夠表達(dá)，用含有p的農(nóng)桿菌（）GV3101侵染擬南芥花序，獲得過表達(dá)植株，通過卡那霉素抗性篩選3代，獲得純合株系，將轉(zhuǎn)擬南芥和野生型擬南芥（WT）種植在含有尖鐮孢的土中，進(jìn)行抗枯萎病能力研究，菌土為尖鐮孢蛭石玉米培養(yǎng)物以0.6%（質(zhì)量比）的接種量混到營養(yǎng)土基質(zhì)中。

1.10 轉(zhuǎn)CGTase擬南芥防御基因的表達(dá)

種植野生型和轉(zhuǎn)擬南芥，14 d后接種尖鐮孢孢子液，通過qPCR分析接菌后6、12、24、48和72 h防御基因（F：AAACCGTGTCATACGAACCA；R：ATCAATGGTGGTGAATGCAA）、（F：ACCCTTATCTTCGCTGCTCTTG；R：ATGTCCCACT TGGCTTCTCG）、（F：GTATGGCTTCTCGTTCAC AT；R：CTAAGAGGCAACTGCAGACT）和（F：GCTTCCTTCTTCAACCACACAGC；R：CGTTGATG TACCGGAATCTGAC）的表達(dá)量，以（F：AACTTTGGTTTGTGTTTTGG；R：TCGACTTGTCAT TAGAAAGAAAGAGATAA）作為內(nèi)參基因。

1.11 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 YUPP-10對尖鐮孢的抑制作用

2.1.1 對菌絲生長的抑制作用 將YUPP-10菌株與尖鐮孢對峙培養(yǎng)7 d時測量抑菌帶寬，發(fā)現(xiàn)在接種細(xì)菌的處理中，菌絲生長受到抑制（圖1），平均抑菌帶寬為0.56 cm。結(jié)果表明YUPP-10菌株對尖鐮孢菌絲生長具有顯著的抑制作用。

2.1.2 對產(chǎn)孢的抑制作用 混合培養(yǎng)尖鐮孢孢子液與YUPP-10發(fā)酵產(chǎn)物的無菌濾液，暗培養(yǎng)24 h，利用光學(xué)顯微鏡和血球計數(shù)板觀察孢子數(shù)量。結(jié)果表明對照的孢子數(shù)為33.40 cfu/mL，無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液對孢子萌發(fā)的抑制率分別98.41%、54.49%和56.49%，處理與對照之間存在顯著差異（表1）。

2.1.3 對孢子萌發(fā)的抑制作用 利用懸滴法培養(yǎng)尖鐮孢孢子液與YUPP-10發(fā)酵產(chǎn)物的混合液，5 h后通過光學(xué)顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，芽管長度超過孢子長度的一半，視為萌發(fā)，通過數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，對照組的孢子萌發(fā)率為52.87%，無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液對孢子萌發(fā)的抑制率分別為51.65%、35.30%和27.75%，在供試濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出顯著差異（表1）。

A、B：YUPP-10處理 Treated by YUPP-10；C：LB培養(yǎng)基處理 Treated by LB medium

表1 YUPP-10處理后對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同Data with different letters indicate significant difference at＜0.05 level. the same as below

2.2 YUPP-10對棉花生長的影響

2.2.1 菌體懸浮液浸種處理對棉花種子發(fā)芽的影響 高濃度的YUPP-10羧甲基纖維素鈉菌體懸浮液對種子發(fā)芽具有抑制作用，而1/2和1/4稀釋液對種子發(fā)芽具有顯著的促進(jìn)作用。同樣，高濃度YUPP-10處理后，種子的芽長低于對照，用稀釋的YUPP-10菌體懸浮液處理后，芽長大于對照，但差異不顯著（表2）。

2.2.2 菌體懸浮液浸種處理對棉花出苗及生長的影響 鑒于高濃度的YUPP-10抑制種子萌發(fā)，采用低濃度的YUPP-10羧甲基纖維素鈉懸浮液（OD600=0.2）浸種處理后播種，統(tǒng)計出苗情況、根長、莖長和植株鮮重等指標(biāo)，結(jié)果表明使用YUPP-10浸種后，能顯著促進(jìn)棉花種子的出苗率，棉花的莖長顯著高于對照，對根長和總鮮重?zé)o顯著影響（表3）。

2.3 YUPP-10發(fā)酵液對棉花枯萎病的防治效果

YUPP-10發(fā)酵液濃度為1×107cfu/mL時對棉花枯萎病的防治效果最好，防治效果達(dá)到45.11%，供試的3個濃度中，1×108和1×107cfu/mL處理后的病情指數(shù)和病株率顯著低于對照（表4、圖2）。

表2 YUPP-10浸種對種子發(fā)芽的影響

2.4 CGTase的水解活性

通過分析YUPP-10菌株的Fosmid文庫，發(fā)現(xiàn)能夠水解-1,4糖苷鍵的物質(zhì)為YUPP-10菌株的分泌蛋白環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase），為驗證CGTase具有降解-1,4糖苷鍵的能力，檢測了其對羧甲基纖維素和葡甘聚糖的降解活性，經(jīng)I-KI染色后，出現(xiàn)了透明圈（圖3），表明CGTase具有水解活性。

表3 YUPP-10浸種處理對棉花生長的影響

表4 YUPP-10菌劑處理對棉花枯萎病病株率、病情指數(shù)的影響及防治效果

圖2 YUPP-10處理棉花對枯萎病的防治效果

2.5 CGTase的抑菌活性

在長有尖鐮孢的平板上添加CGTase后，抑制了菌絲的生長（圖4），通過共培養(yǎng)和懸滴法測定CGTase對尖鐮孢產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明CGTase對兩者均具有顯著的抑制作用（表5）。

2.6 轉(zhuǎn)CGTase擬南芥對枯萎病的抗性評價

在模式植物擬南芥中過表達(dá)，并獲得純合植株。在含有尖鐮孢的基質(zhì)中生長，野生型幼苗表現(xiàn)出葉片黃化，甚至整株壞死，而過表達(dá)植株抗病能力顯著高于野生型（圖5）。

2.7 病原脅迫下擬南芥防御基因的表達(dá)

、、和在植物抗病性中起重要作用，利用qPCR方法檢測擬南芥在尖鐮孢脅迫下防御相關(guān)基因的表達(dá)。在抗病關(guān)鍵時期，轉(zhuǎn)基因擬南芥防御基因在病原脅迫下的表達(dá)量顯著高于野生型（圖6）。

A：羧甲基纖維素carboxymethyl cellulose；B：葡甘聚糖glucomannan

圖4 CGTase的抑菌活性

表5 CGTase處理后對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

圖5 CGTase過表達(dá)擬南芥的抗病能力

3 討論

植物與細(xì)菌的協(xié)同作用已有較多研究，由于細(xì)菌種類和數(shù)量巨大，對植物的微生態(tài)環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用，從而影響植物的健康和生長。在長期的進(jìn)化中，植物也會“選擇”對自己有利的細(xì)菌定殖，包括在植物組織內(nèi)部的定殖[19-21]。內(nèi)生細(xì)菌能促進(jìn)寄主植物生長并防止病原物入侵，且在不同的環(huán)境條件下，內(nèi)生細(xì)菌比根際細(xì)菌更能有效地與寄主植物互作[22-23]。分離自健康棉花組織中的內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10能夠利用葡甘聚糖作為碳源[15]，表明其能夠水解-1,4糖苷鍵[24-26]，真菌細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)是通過-1,4糖苷鍵聚合N-乙酰葡糖胺形成的線性聚合物[27]，能夠利用葡甘聚糖作為碳源的細(xì)菌也具有水解幾丁質(zhì)-1,4糖苷鍵的活性，從而破壞病原真菌的細(xì)胞壁，起到抑制病菌生長的作用。本研究表明，YUPP-10發(fā)酵產(chǎn)物對枯萎病病原菌尖鐮孢的菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用。孢子是已知的抗逆性較強的真菌生命形式之一，可以承受高溫、強酸、高壓等環(huán)境脅迫[28]，能夠直接發(fā)育成新個體，因此有效抑制孢子的萌發(fā)和產(chǎn)孢對抑制病原菌的繁殖力和侵染最有重要作用。

圖6 病原脅迫下擬南芥防御基因的表達(dá)

Nejad等報道了內(nèi)生細(xì)菌能夠顯著改善油菜和番茄的生長發(fā)育[29]，本研究也發(fā)現(xiàn)在適宜的濃度下，YUPP-10菌體懸浮液能夠有效促進(jìn)種子發(fā)芽和幼胚生長，因此YUPP-10菌株具有用作種子包衣劑的潛力。促植物生長是增強植物自身抵抗病蟲害侵染的有效措施，在本研究中，低濃度的YUPP-10浸種處理的棉花種子，其出苗率有顯著的提高，地上部分的生長也有明顯的加強，這也進(jìn)一步證明YUPP-10作為種子包衣劑是合適的選擇。

使用YUPP-10液體菌劑灌根處理，在使用的3個濃度中，1×107cfu/mL對棉花枯萎病的防治效果最好，為大田的應(yīng)用提供了施用參考濃度。蠟狀芽孢桿菌作為枯萎病的防治劑也有相關(guān)報道，如用于番茄枯萎病[30-31]、西瓜枯萎病[32]和香蕉枯萎病[33]的防治。

通過Fosmid文庫，獲得了YUPP-10中能夠降解-1,4糖苷鍵的物質(zhì)為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）[34]。CGTase能夠抑制尖鐮孢菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)。在擬南芥中過表達(dá)，能夠增強植株對枯萎病的抗性。相較于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株、、和等防御基因的表達(dá)量顯著升高。是JA/ET信號通路的標(biāo)志基因[35]，PR1/2是SA信號通路的標(biāo)志基因[36]，qPCR結(jié)果顯示，CGTase可能通過激發(fā)植物SA和JA信號通路抵抗病原菌的侵染。

4 結(jié)論

蠟狀芽孢桿菌菌株YUPP-10能夠有效防治棉花枯萎病，且具有促生長能力。從YUPP-10中篩選到的關(guān)鍵抑菌物質(zhì)CGTase也能夠抑制棉花枯萎病病原菌尖鐮孢生長，轉(zhuǎn)擬南芥部分防御基因在病原脅迫下的表達(dá)量顯著高于野生型，從而增強了植株對病害的耐受性。YUPP-10菌株和分別具有作為棉花枯萎病生防制劑和轉(zhuǎn)基因育種候選基因防治枯萎病資源的前景。

[1] SANOGO S, ZHANG J. Resistance sources, resistance screening techniques and disease management for Fusarium wilt in cotton. Euphytica, 2016, 207(2): 255-271.

[2] ZHANG Z, DIAO H, WANG H, WANG K, ZHAO M. Use ofpolysaccharide to control cotton fusarium wilt, and the mechanism involved. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2019, 158: 149-155.

[3] LANG J, HU J, RAN W, XU Y, SHEN Q. Control of cotton Verticillium wilt and fungal diversity of rhizosphere soils by bio-organic fertilizer. Biology and Fertility of Soils, 2012, 48(2): 191-203.

[4] 張海軍, 李澤方. 綠色木霉GY20對棉花枯萎病菌的抑菌作用. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 21(3): 193-197.

ZHANG H J, LI Z F. Biocontrol mechanism ofGY20 againstf. sp.F12. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2012, 21(3): 193-197. (in Chinese)

[5] 李社增, 鹿秀云, 馬平, 高勝國, 劉杏忠, 劉干. 防治棉花黃萎病的生防細(xì)菌NCD-2的田間效果評價及其鑒定. 植物病理學(xué)報, 2005, 35(5): 451-455.

Li S Z, Lu X Y, Ma P, Gao S G, Liu X Z, Liu G. Evaluation of biocontrol potential of a bacterial strain NCD-2 against cotton Verticillium wilt in field trials. Acta Phytopathologica Sinica, 2005, 35(5): 451-455. (in Chinese)

[6] LI B, LI Q, XU Z, ZHANG N, SHEN Q, ZHANG R. Responses of beneficialSQR9 to different soilborne fungal pathogens through the alteration of antifungal compounds production. Frontiers in Microbiology, 2014, 5: 636.

[7] PEREG L, MCMILLAN M. Scoping the potential uses of beneficial microorganisms for increasing productivity in cotton cropping systems. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 80: 349-358.

[8] 李海薇, 韓萬里, 王夢瑤, 羅明, 韓劍, 顧愛星. 棉花枯萎病拮抗短小芽胞桿菌篩選鑒定及生防研究. 中國生物防治學(xué)報, 2018, 34(3): 440-448.

LI H W, HAN W L, WANG M Y, LUO M, HAN J, GU A X. Screening and identification of antagonistic bacteriaagainst cotton Fusariumwilt and biocontrol research. Chinese Journal of Biological Control, 2018, 34(3): 440-448. (in Chinese)

[9] 柳自清, 張博然, 劉葉, 郭楠楠, 顧愛星. 短小芽孢桿菌KX-33做種衣劑對棉花枯萎病的盆栽防效. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2020, 43(5): 323-329.

LIU Z Q, ZHANG B R, LIU Y, GUO N N, GU A X. Effect ofKX-33 seed coating agent on Verticillium wilt of cotton. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2020, 43(5): 323-329. (in Chinese)

[10] 戴蓬博, 藍(lán)星杰, 張偉衛(wèi), 甘良, 王陽, 宗兆鋒. 生防菌株SC11的鑒定、定殖及對棉花枯萎病防治效果研究. 植物病理學(xué)報, 2016, 46(2): 273-279.

DAI P B, LAN X J, ZHANG W W, GAN L, WANG Y, ZONG Z F. Identification, colonization and disease suppressive effect of strain SC11 against cotton Fusarium wilt. Acta Phytopathologica Sinica, 2016, 46(2): 273-279. (in Chinese)

[11] PLEBAN S, CHERNIN L, CHET I. Chitinolytic activity of an endophytic strain of. Letters in Applied Microbiology, 1997, 25(4): 284-288.

[12] LI J G, JIANG Z Q, XU L P, SUN F F, GUO J H. Characterization of chitinase secreted bystrain CH2 and evaluation of its efficacy against Verticillium wilt of eggplant. BioControl, 2008, 53(6): 931-944.

[13] KISHORE G K, PANDE S. Chitin-supplemented foliar application of chitinolyticreduces severity of Botrytis gray mold disease in chickpea under controlled conditions. Letters in Applied Microbiology, 2007, 44(1): 98-105.

[14] HAMMAMI I, SIALA R, JRIDI M, KTARI N, NASRI M, TRIKI M A. Partial purification and characterization of chiIO8, a novel antifungal chitinase produced byIO8. Journal of Applied Microbiology, 2013, 115(2): 358-366.

[15] 周京龍, 馮自力, 馮鴻杰, 李云卿, 袁媛, 李志芳, 魏鋒, 師勇強, 趙麗紅, 孫正祥, 朱荷琴, 周燚. 棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10對棉花黃萎病的防治作用及機制. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(14): 2717-2727.

ZHOU J L, FENG Z L, FENG H J, LI Y Q, YUAN Y, LI Z F, WEI F, SHI Y Q, ZHAO L H, SUN Z X, ZHU H Q, ZHOU Y. Biocontrol effect and mechanism of cotton endophytic bacteriumYUPP-10 against Verticillium wilt in. Scientia Agricultura Sinica, 2017, 50(14): 2717-2727. (in Chinese)

[16] LI S K, JI Z Q, ZHANG J W, GUO Z Y, WU W J. Synthesis of 1-acyl-3-isopropenylbenzimidazolone derivatives and their activity against. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(5): 2668-2672.

[17] 朱荷琴, 馮自力, 李志芳, 趙麗紅, 師勇強. 蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種(系)的抗黃萎病性. 中國棉花, 2010, 37(12): 15-17.

Zhu H Q, Feng Z L, Li Z F, Zhao L H, Shi Y Q. Dip quantitative fungal solution method by using vermiculite sand without bottom paper bowl to identify cotton varieties (lines) of resistance to Verticillium wilt. China Cotton, 2010, 37(12): 15-17. (in Chinese)

[18] CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip: a simplified method for-mediated transformation of. The Plant Journal, 1998, 16(6): 735-743.

[19] Marasco R, Rolli E, Ettoumi B, Vigani G, Mapelli F, Borin S, Abou-Hadid A F, El-Behairy U A, Sorlini C, Cherif A, Zocchi G, Daffonchio D. A drought resistance- promoting microbiome is selected by root system under desert farming. Plos One, 2012, 7(10): e48479.

[20] RASHID S, CHARLES T C, GLICK B R. Isolation and characterization of new plant growth-promoting bacterial endophytes. Applied Soil Ecology, 2011, 61(5): 217-224.

[21] HARDOIM P R, van OVERBEEK L S, van ELSAS J D. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth. Trends in Microbiology, 2008, 16(10): 463-471.

[22] ALI S, CHARLES T C, GLICK B R. Delay of flower senescence by bacterial endophytes expressing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Journal of Applied Microbiology, 2012, 113(5): 1139-1144.

[23] COUTINHO B G, LICASTRO D, MENDON?A-PREVIATO L, CáMARA M, VENTURI V. Plant-influenced gene expression in the rice endophyteM130. Molecular Plant- Microbe Interactions, 2015, 28(1): 10-21.

[24] KATSURAYA K, OKUYAMA K, HATANAKA K, OSHIMA R, SATO T, MATSUZAKI K. Constitution of konjac glucomannan: chemical analysis and13C NMR spectroscopy. Carbohydrate Polymers, 2003, 53(2): 183-189.

[25] FANG W, WU P. Variations of konjac glucomannan (KGM) fromand its refined powder in China. Food Hydrocolloids, 2004, 18(1): 167-170.

[26] LAFARGE C, CAYOT N, HORY C, GONCALVES L, CHASSEMONT C, Le BAIL P. Effect of konjac glucomannan addition on aroma release in gels containing potato starch. Food Research International, 2014, 64: 412-419.

[27] PANGBURN S H, TRESCONY P V, HELLER J. Lysozyme degradation of partially deacetylated chitin, its films and hydrogels. Biomaterials, 1982, 3(2): 105-108.

[28] CHEN J, PENG H, WANG X, SHAO F, YUAN Z, HAN H. Graphene oxide exhibits broad-spectrum antimicrobial activity against bacterial phytopathogens and fungal conidia by intertwining and membrane perturbation. Nanoscale, 2014, 6(3): 1879-1889.

[29] NEJAD P, JOHNSON P A. Endophytic bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression in oilseed rape and tomato. Biological Control, 2000, 18(3): 208-215.

[30] ABDALLAH R A B, MOKNI-TLILI S, NEFZI A, JABNOUN- KHIAREDDINE H, DAAMI- REMADI M. Biocontrol of Fusarium wilt and growth promotion of tomato plants using endophytic bacteria isolated fromorgans. Biological Control, 2016, 97(10): 80-88.

[31] AJILOGBA C F. RAPD delineation of nativespp. and analyses of their biocontrol effect on tomato Fusarium wilt[D]. Mafikeng Campus of the North-West University, 2013.

[32] ABDALLAH R A, NE U O, JABNOUN-KHIAREDDINE H, MOKNI-TLILI S, NEFZI A, MEDIMAGH-SAIDANA S, DAAMI- REMADI M. Endophyticspp. from wild solanaceae and their antifungal potential againstf. sp.i elucidated using whole cells, filtrate cultures and organic extracts. Journal of Plant Pathology and Microbiology, 2015, 6: 11.

[33] 傅瑩, 黃益燕, 肖愛萍, 游春平. 蠟狀芽孢桿菌菌株255誘導(dǎo)香蕉產(chǎn)生抗性相關(guān)酶初步研究. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 38(9): 75-77.

FU Y, HUANG Y Y, XIAO A Q, YOU C P. Preliminary study on the resistant-related enzymes from banana by the induction ofstrain 255. Guangdong Agricultural Sciences, 2011, 38(9): 75-77. (in Chinese)

[34] ZHOU J, FENG Z, LIU S, WEI F, SHI Y, ZHAO L, HUANG W, ZHOU Y, FENG H, ZHU H. CGTase, a novel antimicrobial protein fromYUPP-10, suppressesand mediates plant defence responses. Molecular Plant Pathology, 2021, 22(1): 130-144.

[35] GUO X, STOTZ H U. Defense againstinis dependent on jasmonic acid, salicylic acid, and ethylene signaling. Molecular plant-microbe interactions, 2007, 20(11): 1384-1395.

[36] GLAZEBROOK J, CHEN W, ESTES B, CHANG H S, NAWRATH C, MéTRAUX J P, ZHU T, KATAGIRI F. Topology of the network integrating salicylate and jasmonate signal transduction derived from global expression phenotyping. The Plant Journal, 2003, 34(2): 217-228.

Biocontrol Effect and Mechanism of Cotton Endophytic Bacterium YUPP-10 and Its Secretory Protein CGTase Against Fusarium Wilt in Cotton

ZHOU JingLong1,2, FENG ZiLi2, WEI Feng2, ZHAO LiHong2, ZHANG YaLin2, ZHOU Yi1, FENG HongJie2, ZHU HeQin2

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan

【】Fusarium wilt is one of the most important soil-borne diseases in cotton planting. Chemical methods are mainly used to control this disease, however, it has certain impact on the environment, human and animal safety. Biological control has become an important way to control cotton Fusarium wilt because of its high specificity and safety. The objective of this study is to screen an efficient antagonistic bacteria, and characterize the biocontrol mechanism of bacteria against Fusarium wilt, thus providing a technical basis for cotton Fusarium wilt control with biocontrol bacteria.【】In a previous study, an endophytic bacteriumYUPP-10 was isolated from vascular of cotton, which can hydrolyze polysaccharides with-1,4 linkage. The effects of YUPP-10 on hyphal growth, sporulation, and spore germination ofwere tested using the confront culture method, enclosed chamber test and hanging drop method, respectively. The seeds were soaked by YUPP-10, and then, the seeding germination and the biomass of cotton were detected. The cotton were cultivated in substrate with, and after a week of growth, YUPP-10 cultured with LB liquid medium was treated at different concentrations (1×108, 1×107and 1×106cfu/mL, respectively), and the control efficacy against Fusarium wilt was studied in the greenhouse. The key antibacterial substances of YUPP-10 were obtained by Fosmid library, and the direct effects of recombinant cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) onhyphal growth, sporulation, and spore germination were studied. The overexpression vector was transformed intoCol-0 via the floral dip method. The resistance of-overexpressing transgenic plants against Fusarium wilt was assessed with antechnique. The transcriptional levels of some defense genes were analyzed under pathogen challenge.【】YUPP-10 significantly inhibited the hyphal growth, sporulation, and spore germination of, the most inhibition rate of spore yield and germination was 98.41% and 51.65%, respectively. Low concentration of YUPP-10 could promote the germination rate, emergence rate and stem length of cotton seeds. After the treatment of YUPP-10, the diseased plant rate and disease index were significantly lower than those of the control group. The control efficacy was 45.11% at the concentration of 1×107cfu/mL. CGTase was the key antimicrobial substance of YUPP-10, the effects of added CGTase on the transparent circles of carboxymethyl cellulose and glucomannan were measured, the results showed that CGTase could hydrolyze polysaccharides with-1,4 linkage. CGTase also had significant inhibitory effects on the growth, sporulation and spore germination of the pathogen, the most inhibition rate of spore yield and germination was 62.63% and 30.83%, respectively. The-overexpressingenhanced disease resistance by enhancing the expression of defense genes.【】YUPP-10 is an efficient biocontrol agent that inhibits thegrowth, promots germination rate, emergence rate and stem length of cotton seeds, and protects cotton plant frominfection. CGTase can inhibit the growth of, and its transgenicenhances the resistance to Fusarium wilt.

; cotton Fusarium wilt;f. sp.; cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase); control efficacy

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.011

2020-11-14；

2020-12-03

國家自然科學(xué)基金（31901938）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610162021031）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程

周京龍，E-mail：zhoujl510@163.com。通信作者朱荷琴，E-mail：heqinanyang@163.com。通信作者周燚，E-mail：zhouyi@yangtzeu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）