去離子甲酰胺在腦腱黃瘤病基因診斷中的應(yīng)用

宮磊，張志堅(jiān)，楊建課，高繼光，戚之琳

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

腦腱黃瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis，CTX)是一種常染色體隱性遺傳的脂質(zhì)代謝性疾病。90%以上的病例是由于CYP27A1基因突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物固醇27-羥化酶功能異常，繼而引起膽酸合成障礙而發(fā)病，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)損害，如青少年白內(nèi)障、肌腱黃瘤、早發(fā)性動脈硬化、進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙等。通過基因檢測早期明確診斷并采用鵝去氧膽酸治療對于阻止或延緩病情發(fā)展具有重要的意義[1-3]。在對CYP27A1基因的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)由于其編碼序列GC含量較高，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，很容易出現(xiàn)非特異性條帶，不利于后續(xù)對PCR產(chǎn)物的測序分析。為提高PCR反應(yīng)的特異性，我們采用了熱啟動PCR，并在反應(yīng)體系中添加了去離子甲酰胺，以優(yōu)化CYP27A1基因檢測的方法，同時也為高GC比DNA片段的擴(kuò)增提供方法上的參考。

1 資料與方法

1.1血液標(biāo)本 健康人體外周血標(biāo)本1例，肝素鋰抗凝，-20℃冰柜凍存。

1.2研究方法

1.2.1主要儀器和試劑 Mastercycler Gradient PCR儀(Eppendorf公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(Axygen公司)；去離子甲酰胺(上海生工生物工程公司)；熱啟動Taq酶(Takara公司)；DL2000 DNA Marker(Takara公司)；dNTPs(Takara公司)；PCR清潔試劑盒(Axygen公司)。

1.2.2DNA提取 將全血室溫解凍后，使用血液基因組DNA提取試劑盒提取出基因組DNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)和合成 NCBI網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)4對引物分別擴(kuò)增CYP27A1基因4個片段，涵蓋CYP27A1基因全部外顯子以及外顯子內(nèi)含子接頭處。引物序列、位置以及擴(kuò)增片段的編號、大小、GC含量見表1。

表1 引物序列、位置以及擴(kuò)增片段的編號、大小、GC含量

1.2.4不同濃度去離子甲酰胺條件下采用熱啟動PCR擴(kuò)增CYP27A1基因目標(biāo)片段 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的情況下擴(kuò)增CYP27A1基因片段2；在不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的情況下擴(kuò)增CYP27A1基因片段1、3、4。PCR總反應(yīng)體積為50 μl，其中熱啟動Taq酶1.25 U，MgCl21.5mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上游及下游引物各0.25 μmol/L。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s ，72℃延伸1 min 30 s，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。對PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5去離子甲酰胺對PCR擴(kuò)增效率影響的分析 采用Image J 軟件分別測量不同去離子甲酰胺濃度條件下擴(kuò)增出的4條目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值。然后采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較不同濃度下目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值差異。

1.2.6測序分析 挑選4個目標(biāo)帶的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)PCR清潔試劑盒純化后進(jìn)行測序分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度去離子甲酰胺條件下CYP27A1基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1片段2的擴(kuò)增結(jié)果 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～8%時，均擴(kuò)增出目標(biāo)帶，但濃度為7%和8%時，目標(biāo)帶明顯減弱。濃度為9%和10%時，未擴(kuò)增出目標(biāo)帶。在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～3%時可見非特異性條帶，濃度為4%～8%時，未見非特異性帶。

2.1.2片段1、3、4的擴(kuò)增結(jié)果 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～6%時，均擴(kuò)增出目標(biāo)帶；在反應(yīng)體系不含去離子甲酰胺時，擴(kuò)增產(chǎn)物均存在非特異性帶，當(dāng)去離子甲酰胺濃度為3%～6%時，均未見非特異性條帶，見圖1。

注：圖A：片段1的擴(kuò)增結(jié)果；圖B：片段2的擴(kuò)增結(jié)果；圖C：片段3的擴(kuò)增結(jié)果；圖D：片段4的擴(kuò)增結(jié)果； M為DL2000 DNA Marker；圖A、B、C、D中第1至第7泳道對應(yīng)的去離子甲酰胺濃度均依次為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%。

2.2不同去離子甲酰胺濃度條件下擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo)帶光強(qiáng)度值的比較結(jié)果 經(jīng)單因素分差分析，去離子甲酰胺濃度在0、1%、2%、3%、4%、5%、6%條件下擴(kuò)增出的目標(biāo)帶光強(qiáng)度值無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 不同去離子甲酰胺濃度下擴(kuò)增CYP27A1基因目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值比較

2.3DNA測序結(jié)果CYP27A1基因4個目標(biāo)帶的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析和NCBI 網(wǎng)站BLAST 比對驗(yàn)證為目標(biāo)序列，見圖2。

注：圖A：片段1的測序結(jié)果；圖B：片段2的的測序結(jié)果；圖C：片段3的的測序結(jié)果；圖D：片段4的的測序結(jié)果。

3 討論

采用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因然后進(jìn)行測序分析是基因檢測或診斷中常用的一種簡便而經(jīng)濟(jì)的方法。在使用PCR擴(kuò)增高GC含量的DNA片段時，可能因?yàn)橥嘶饡r模板易形成鏈內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)產(chǎn)量低、特異性低的問題[4-6]。由于甲酰胺能夠減弱核苷酸之間的氫鍵，消除局部的二級結(jié)構(gòu)，Sarkar G等[4]在擴(kuò)增GC含量為55%的DRD2基因片段時，為了提高特異性，最先在PCR反應(yīng)體系中加入甲酰胺，使其終濃度分別為1.25%、2.5%、5%、10%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酰胺濃度為5%時不僅提高了擴(kuò)增的效率，而且完全消除了非特異性帶，而當(dāng)甲酰胺濃度為10%時，未擴(kuò)增出目標(biāo)片段。之后相繼有學(xué)者報(bào)道一定濃度的甲酰胺可以提高高GC比片段擴(kuò)增的效率和特異性，但不同研究結(jié)果所顯示的甲酰胺在PCR反應(yīng)體系中的最佳使用濃度存在差異，有3%、4%和5%[6-8]。Strien J等[9]在分別使用HotStarTaq 聚合酶、 DAp GoldStar○RDNA聚合酶、OneTaq○RDNA聚合酶并添加甲酰胺的情況下擴(kuò)增 GC比分別為56%和82%片段時，未獲得成功，因而不建議甲酰胺作為PCR添加劑時與這些酶聯(lián)用。本研究在擴(kuò)增CYP27A1基因4個高GC含量的片段時，為了提高PCR反應(yīng)的特異性，在Mg2+濃度為1.5 mmol/L的情況下，首先采用了熱啟動PCR方法，結(jié)果均擴(kuò)增出目標(biāo)帶，但4個目標(biāo)帶的擴(kuò)增均見非特異性條帶。為進(jìn)一步提高反應(yīng)的特異性，我們向反應(yīng)體系中添加了不同濃度的去離子甲酰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的特異性明顯增強(qiáng)，當(dāng)去離子甲酰胺的終濃度為4%、5%和6%時，4個片段的擴(kuò)增均完全消除了非特異性帶。為進(jìn)一步了解去離子甲酰胺的濃度是否會影響目標(biāo)帶的擴(kuò)增效率，我們采用了Image J軟件測量反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺以及去離子甲酰胺濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6% 7種情況下4個目標(biāo)條帶的光強(qiáng)度值，比較不同濃度下目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值差異，結(jié)果顯示無明顯差異，提示去離子甲酰胺濃度在6%及以下時，對熱啟動PCR的擴(kuò)增效率無影響。而當(dāng)我們將去離子甲酰胺的濃度增加至7%或8%來擴(kuò)增CYP27A1基因片段2時，目標(biāo)帶明顯減弱；增至9%或10%時，PCR反應(yīng)完全被抑制，這一結(jié)果與Sarkar G等[4]在10%的甲酰胺濃度下未擴(kuò)增出目標(biāo)帶以及Kovárová M等[7]報(bào)道的2M(相當(dāng)于8%)的甲酰胺可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降90%相似。綜合CYP27A1基因4個片段的擴(kuò)增結(jié)果及已有的報(bào)道，我們認(rèn)為采用熱啟動PCR，同時向反應(yīng)體系中添加去離子甲酰胺能有效擴(kuò)增出高GC含量的DNA片段，同時避免非特異性帶的產(chǎn)生，但反應(yīng)體系中去離子甲酰胺的濃度宜控制在4%～6%。這一方法不僅適用于腦腱黃瘤病的致病基因—CYP27A1基因的檢測，也可用于其他富含GC的基因的檢測。