應(yīng)用real-time PCR定量檢測(cè)果園葡萄霜霉病菌潛伏侵染

杜娟 李金 張濤 張游 姚珮 顧沛雯

摘要： 為明確葡萄霜霉病菌潛伏侵染階段的菌量與病害發(fā)生的關(guān)系，本研究對(duì)賀蘭山東麓寧夏立蘭酒莊釀酒葡萄園3個(gè)試驗(yàn)樣地進(jìn)行采樣調(diào)查，分析3個(gè)樣地檢測(cè)的分子病情指數(shù)（MDI）與果園田間調(diào)查的病情指數(shù)（DI）的相關(guān)性。結(jié)果表明，寧夏立蘭酒莊釀酒葡萄園3個(gè)樣地的MDI和DI呈極顯著相關(guān)，3個(gè)樣地的MDI均與采樣后15 d的DI擬合性最高;當(dāng)MDI值為0.003 5～0.184 1時(shí)，采樣后12 d葡萄霜霉病在果園零星發(fā)生。MDI大于0.003 5時(shí)，可作為當(dāng)?shù)蒯劸破咸阉共》乐晤A(yù)警指標(biāo)。

關(guān)鍵詞： 葡萄霜霉菌;real-time PCR;分子病情指數(shù);田間病情指數(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.631.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）04-0861-06

Quantitative detection of latent infection of grape downy mildew in field by real-time PCR

DU Juan， LI Jin， ZHANG Tao， ZHANG You， YAO Pei， GU Pei-wen

（College of Agronomy， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： ?In order to clarify the relationship between the latent infection amount of grape downy mildew in the orchard and the occurrence of the disease， three sample plots in Ningxia Lilan vineyard were investigated， and the correlation between molecular-detected disease index（MDI） and orchard disease index （DI） was analyzed. The results showed that there was a very significant correlation between MDI and DI in three sample plots of Ningxia Lilan vineyard， and the MDI of the three sample plots had the highest fitting with the DI on the 15th day after sampling. When the MDI value ranged from 0.003 5 to 0.184 1， grape downy mildew occurred sporadically in the orchard on the 12th day after sampling. When MDI is greater than 0.003 5， it can be used as an early warning index for prevention and control of local wine grape downy mildew.

Key words： Plasmopara viticola;real-time PCR;molecular-detected disease index;disease index

由葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）侵染引起的葡萄霜霉病是世界范圍內(nèi)葡萄生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一[1-2]，也是中國(guó)葡萄生產(chǎn)中最重要的病害和監(jiān)控研究的對(duì)象[3-5]。該病害主要依靠氣流傳播，具有發(fā)生范圍廣、流行速度快、危害程度重的特點(diǎn)[6]。潛伏期菌量的定量檢測(cè)是病害進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)預(yù)警的關(guān)鍵[7-8]。在潛伏期，病原菌在葡萄葉片內(nèi)不斷蔓延，一旦進(jìn)入發(fā)病期，在適宜條件下葡萄霜霉病便會(huì)大面積流行，給葡萄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[9]。因此，對(duì)處于潛伏侵染狀態(tài)的葡萄霜霉病菌進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的定量分析，不僅可實(shí)現(xiàn)葡萄霜霉病的早期診斷和對(duì)該病流行趨勢(shì)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，還可及早制定正確防控策略并采取防控措施，減少產(chǎn)量損失。

近年來(lái)，real-time PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物體內(nèi)病原菌潛伏侵染定量研究[10-11]。Yan等[12]首次提出分子病情指數(shù)（MDI）的概念，即病原菌DNA濃度與寄主植物DNA濃度的比值，并將它用于衡量病害潛伏侵染的菌量。Zheng等[13]利用人工接種的葉片建立了MDI和田間調(diào)查的病情指數(shù)（DI）的線(xiàn)性關(guān)系，從而對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行估測(cè)。潘陽(yáng)等[14]建立了小麥條銹病菌雙重real-time PCR檢測(cè)體系，可在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)確定病原菌和寄主植物2種目標(biāo)DNA的濃度并獲得MDI。Knüfer等[15]應(yīng)用real-time PCR技術(shù)分析病害進(jìn)展曲線(xiàn)下的面積來(lái)研究油菜黃萎病的潛伏期菌量。劉琦等[16]發(fā)現(xiàn)小麥條銹病潛伏期的MDI與DI之間存在極顯著相關(guān)性，表明可以利用MDI對(duì)田間實(shí)際發(fā)病情況進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。Liu等[17]研究認(rèn)為，及時(shí)、準(zhǔn)確地量化病原菌潛伏侵染階段的菌量，明確MDI與田間調(diào)查得到的DI的關(guān)系是病害預(yù)測(cè)和防治的關(guān)鍵。

目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了一系列對(duì)葡萄霜霉病菌潛伏侵染階段的定性或定量研究[18-21]，大多為室內(nèi)研究，有關(guān)果園葡萄霜霉病菌早期潛伏侵染定量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在前期建立了葡萄霜霉病菌的real-time PCR定量檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)處于潛伏侵染階段的樣品進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，獲得侵染早期病原菌在寄主中的MDI值，病害發(fā)生后進(jìn)行果園病情調(diào)查，計(jì)算DI值，通過(guò)葡萄霜霉病菌潛育期的MDI和DI的回歸分析，確定MDI和DI的相關(guān)性，為有效測(cè)定葡萄霜霉病菌潛伏侵染階段的菌量和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)該病害的流行趨勢(shì)提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)在寧夏賀蘭山東麓立蘭酒莊釀酒葡萄園（38°16′N(xiāo)，105°57′E，海拔高度1 190 m）進(jìn)行，7～9月為釀酒葡萄霜霉病發(fā)生期，此期間平均氣溫22.01 ℃，平均濕度56.16%。供試釀酒葡萄品種為赤霞珠（Cabernet Sauvignon），樹(shù)齡7 a，株距×行距：3 m×5 m，樹(shù)形為斜干水平形，滴管水肥一體化，正常農(nóng)事管理。

1.2 取樣與調(diào)查

設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)樣地，記作LF-1、LF-2和LF-3，每塊試驗(yàn)樣地面積10.5 hm2（300 m×350 m），分割成126個(gè)50 m×50 m的樣區(qū)。在葡萄霜霉病未顯示癥狀時(shí)（2019年7月9日）采集樣品。每個(gè)樣區(qū)標(biāo)記5株葡萄樹(shù)，每株隨機(jī)采集3片葉，共計(jì)15片葉，混合后作為一個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行MDI的檢測(cè)。

采樣結(jié)束后，對(duì)126個(gè)樣區(qū)的相應(yīng)位置進(jìn)行病情調(diào)查，每3 d調(diào)查1次，至果園開(kāi)始零星發(fā)?。s第12 d），隨后統(tǒng)計(jì)第12 d、15 d和18 d的發(fā)病情況，進(jìn)行DI的計(jì)算。DI調(diào)查點(diǎn)與MDI采樣點(diǎn)為同一株葡萄樹(shù)。調(diào)查時(shí)，在每株葡萄樹(shù)上部、中部、下部隨機(jī)調(diào)查30張葉片，每個(gè)樣區(qū)共計(jì)調(diào)查150張葉片，記錄葡萄霜霉病普遍率與嚴(yán)重度，病害發(fā)生程度分級(jí)指標(biāo)參照農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所頒布的葡萄霜霉病發(fā)生程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[22]。

DI=普遍率×平均嚴(yán)重度×100

普遍率是指發(fā)病的普遍程度，即發(fā)病率。普遍率=（病葉數(shù)/調(diào)查總?cè)~數(shù)）×100%

平均嚴(yán)重度是指發(fā)病位點(diǎn)的嚴(yán)重程度。

平均嚴(yán)重度=∑（發(fā)病病級(jí)×該級(jí)病葉數(shù)）調(diào)查總病葉數(shù)×100%

1.3 樣品real-time PCR檢測(cè)

1.3.1 葡萄葉片DNA的提取 按照E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit（美國(guó)Omega Bio-tek公司產(chǎn)品）說(shuō)明書(shū)提取每個(gè)樣區(qū)葡萄葉片總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Real-time PCR定量檢測(cè)葉片DNA和樣品中病原菌DNA 根據(jù)GenBank中葡萄EF1-α基因（登錄號(hào)：XM002284888.3）設(shè)計(jì)引物F-g-6、R-g-6，擴(kuò)增葡萄葉片DNA。采用李文學(xué)等[21]報(bào)道的引物F-cox-Pv、R-Pv擴(kuò)增葡萄霜霉病菌DNA。采用qTOWER 2.2熒光定量PCR儀（德國(guó)Jena 公司產(chǎn)品）進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。

Real-time PCR反應(yīng)體系（20.0 μl）：2×Trans Start Tip Green SuperMix 10.0 μl（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），正反引物（10 μmol/L）各0.4 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O補(bǔ)足。葡萄葉片和葡萄霜霉病菌real-time PCR反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：將已知質(zhì)量濃度的葡萄葉片和葡萄霜霉病菌的DNA質(zhì)量濃度和各自的Ct值，通過(guò)軟件real-time PCR soft 2.2分別生成葡萄葉片DNA質(zhì)量濃度和葡萄霜霉病菌DNA質(zhì)量濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中葡萄霜霉病菌的線(xiàn)性方程為Y1=18.01-3.60x1（R2=0.992 97），x1為葡萄霜霉病菌DNA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（lgC），Y1為葡萄霜霉病菌的Ct值;葡萄葉片的線(xiàn)性分析方程為Y2=26.38-3.06x2（R2=0.995 98），其中x2為葡萄葉片DNA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（lgC），Y2為葡萄葉片的Ct值。同時(shí)得到葡萄霜霉菌DNA質(zhì)量濃度定量檢測(cè)的最小檢測(cè)限為1.0×10-4ng/μl，而葡萄葉片DNA質(zhì)量濃度定量檢測(cè)最小檢測(cè)限為1.0×10-2ng/μl。

1.3.3 MDI的計(jì)算 參照閆佳會(huì)等[23]的方法分別計(jì)算每個(gè)樣區(qū)的MDI。

MDI=葡萄霜霉病菌DNA質(zhì)量濃度/葡萄葉片DNA質(zhì)量濃度

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)3個(gè)試驗(yàn)樣地的MDI與DI通過(guò)Excel 2016和SPSS 22.0進(jìn)行回歸分析，確定其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LF-1試驗(yàn)樣地的MDI和DI的回歸分析

應(yīng)用SPSS軟件和Excel對(duì)立蘭釀酒葡萄園LF-1試驗(yàn)樣地的MDI與采樣后12 d、15 d和18 d果園調(diào)查的DI進(jìn)行回歸分析。LF-1樣地的MDI和DI回歸分析結(jié)果見(jiàn)圖1，MDI與采樣后12 d DI的回歸方程為Y=48.211 0x+0.053 8（R2=0.779 7，P<0.01）;MDI與采樣后15 d DI的回歸方程為Y=86.281 0x+0.035 4（R2=0.903 3，P<0.01）;MDI與采樣后18 d DI的回歸方程為Y=111.360 0x+0.143 5（R2=0.875 8，P<0.01），結(jié)果表明，潛伏侵染階段的MDI與DI極顯著相關(guān)。當(dāng)檢測(cè)的MDI值在0.003 5～0.053 4時(shí)，12 d后葡萄霜霉病在果園零星發(fā)生。

綜合3次病情的回歸結(jié)果分析，直線(xiàn)斜率為48.211～111.360，即隨田間病情指數(shù)調(diào)查時(shí)間的延后，利用MDI預(yù)測(cè)DI的單位增長(zhǎng)率為48.211～111.360，差異較大。直線(xiàn)截距為0.035 4～0.143 5，差異較小。MDI與采樣后15 d DI的回歸方程的R2最高，此時(shí)MDI的最大檢測(cè)值為0.053 4，其相應(yīng)的DI的最大值為3.560。

2.2 LF-2試驗(yàn)樣地MDI和DI的回歸分析

LF-2樣地回歸分析結(jié)果見(jiàn)圖2，MDI與采樣后12 d DI的回歸方程為Y=50.126 0x+0.501 0（R2=0.819 9，P<0.01）;MDI與采樣后15 d DI的回歸方程為Y=84.243 0x+0.560 9（R2=0.913 7，P<0.01）;MDI與采樣后18 d DI的回歸方程為Y=100.660 0x+1.016 1（R2=0.883 4，P<0.01），結(jié)果表明，潛伏侵染階段的MDI與DI極顯著相關(guān)。當(dāng)檢測(cè)的MDI值為0.009 9～0.165 1時(shí)，采樣后12 d葡萄霜霉病在果園零星發(fā)生。

綜合3次病情的回歸結(jié)果分析，直線(xiàn)斜率為50.126～100.660，即隨調(diào)查田間病情指數(shù)時(shí)間的延后，利用MDI預(yù)測(cè)DI的單位增長(zhǎng)率為50.126～100.660。直線(xiàn)截距為0.501 0～1.016 1，差異較小。MDI與采樣后15 d的DI回歸方程的R2最高，MDI的檢測(cè)范圍在0～0.165 1，其相應(yīng)的DI范圍在0～16.000。LF-2試驗(yàn)樣地發(fā)病率較高，42個(gè)樣區(qū)中有30個(gè)檢測(cè)到MDI，且MDI值越大，發(fā)病越嚴(yán)重。

2.3 LF-3試驗(yàn)樣地MDI和DI的回歸分析

LF-3樣地回歸分析結(jié)果見(jiàn)圖3，MDI與采樣后12 d DI的回歸方程為Y=44.041 0x+0.279 0（R2=0.862 6，P<0.01）;MDI與采樣后15 d DI的回歸方程為Y=80.089 0x+0.702 0（R2=0.896 1，P<0.01）;MDI與采樣后18 d DI的回歸方程為Y=98.247 0x+1.205 3（R2=0.828 1，P<0.01），結(jié)果表明，潛伏侵染階段的MDI與DI極顯著相關(guān)。當(dāng)檢測(cè)的MDI值為0.011 3～0.184 1時(shí)，采樣后12 d葡萄霜霉病在果園零星發(fā)生。

綜合LF-3試驗(yàn)樣地3次病情的回歸結(jié)果分析，直線(xiàn)斜率在44.041～98.247，即隨調(diào)查田間病情指數(shù)時(shí)間的延后，利用MDI預(yù)測(cè)DI的單位增長(zhǎng)率為44.041～98.247。直線(xiàn)截距為0.279 0～1.205 3，差異較小。MDI與采樣后15 d試驗(yàn)樣地DI的回歸方程的R2最高，MDI的檢測(cè)范圍為0～0.184 1，其相應(yīng)的DI范圍在0～13.33。LF-3試驗(yàn)樣地MDI與采樣后15 d DI的擬合性均低于LF-1和LF-2。

3 討論

明確潛伏侵染階段的菌量對(duì)于植物病害的預(yù)測(cè)和防治至關(guān)重要[23]。預(yù)測(cè)植物病害初始病情的傳統(tǒng)方法主要是田間調(diào)查或室內(nèi)離體培養(yǎng)[9， 24]，傳統(tǒng)方法預(yù)測(cè)與田間病害實(shí)際發(fā)生情況差異較大，預(yù)測(cè)結(jié)果極為不準(zhǔn)確。使用real-time PCR方法獲得的MDI在病害流行學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用前景，相比于傳統(tǒng)方法更加精確合理，更適用于果園病害早期監(jiān)測(cè)預(yù)警等流行病學(xué)的研究[22]，是一種可靠的研究果園中葡萄霜霉病菌潛伏侵染的方法。

本研究通過(guò)對(duì)寧夏立蘭酒莊釀酒葡萄園3個(gè)試驗(yàn)樣地的MDI和DI的分析發(fā)現(xiàn)，二者之間呈極顯著相關(guān)，這與Zheng等[13]和閆佳會(huì)等[23]在小麥白粉病和小麥條銹病上的研究結(jié)果相一致。3個(gè)試驗(yàn)樣地均能檢測(cè)到葡萄霜霉病菌，且LF-1試驗(yàn)樣地存在MDI最低檢測(cè)值為零，說(shuō)明應(yīng)用此方法對(duì)果園樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要保證有充足的樣本量才能夠代表一個(gè)試驗(yàn)樣地的分析結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)試驗(yàn)樣地中都存在MDI的檢測(cè)值不為零，但其DI值為零的情況。這一結(jié)果說(shuō)明應(yīng)用real-time PCR可以有效檢測(cè)到尚未顯示癥狀的葡萄葉片中微量的潛伏侵染階段的菌量。綜合3個(gè)試驗(yàn)樣地調(diào)查的數(shù)據(jù)，當(dāng)MDI檢測(cè)值為0.003 5～0.184 1時(shí)，12 d后葡萄霜霉病在果園零星發(fā)生。取MDI值大于0.003 5作為防治預(yù)警指標(biāo)?？紤]到能檢測(cè)到MDI時(shí)，葡萄霜霉病菌已經(jīng)侵染到寄主體內(nèi)，建議在防治時(shí)采用內(nèi)吸性殺菌劑進(jìn)行防治。

閆佳會(huì)等[23]認(rèn)為MDI與DI的回歸分析成功的關(guān)鍵在于采樣時(shí)間和調(diào)查時(shí)間的確定。本研究采樣時(shí)間是依據(jù)寧夏賀蘭山東麓地區(qū)采樣年度的氣候條件和往年果園最早出現(xiàn)病害的日期綜合考量確定的。寧夏立蘭酒莊地處賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)氣候干旱、少雨，葡萄霜霉病一般在7月中下旬開(kāi)始發(fā)生，8月進(jìn)入盛發(fā)期[6，25-26]，因此本研究在7月上旬果園病害發(fā)生前進(jìn)行樣品采集，果園初見(jiàn)病斑時(shí)期進(jìn)行果園調(diào)查，保證了在一個(gè)潛育期內(nèi)完成果園樣品檢測(cè)和病情調(diào)查，避免了葡萄霜霉病菌再侵染對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的干擾。

在植物病害的研究中，應(yīng)用real-time PCR對(duì)植物病原菌潛伏侵染的研究已有很多[27-29]，Duvivier等[30]建立了空氣中小麥條銹菌孢子密度的real-time PCR檢測(cè)體系，用于預(yù)測(cè)田間病情。在MDI的應(yīng)用方面，初炳瑤等[31]應(yīng)用檢測(cè)到的MDI值，并結(jié)合病情調(diào)查進(jìn)行分析，對(duì)3種小麥條銹菌殺菌劑的防治效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，證實(shí)了MDI在藥劑篩選中應(yīng)用的可行性。劉琦等[16]結(jié)合光譜數(shù)據(jù)將MDI值轉(zhuǎn)化為建立模型所需的分類(lèi)標(biāo)簽，驗(yàn)證3種模型對(duì)小麥條銹病潛伏期定性識(shí)別的準(zhǔn)確率。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證明了采用MDI的分析方法在植物病害防治研究中的應(yīng)用前景廣泛。本研究通過(guò)real-time PCR建立的果園葡萄霜霉病菌潛伏侵染的MDI方法能夠快速、準(zhǔn)確地定位發(fā)病中心和潛伏侵染階段菌量，進(jìn)而在早期對(duì)葡萄霜霉病的發(fā)生做出預(yù)警，指導(dǎo)果園病害防治工作，有效減少農(nóng)藥使用量。此外，由于葡萄霜霉病的發(fā)生還受到氣象條件的影響，如遇降雨時(shí)，即使具有相同MDI值，葡萄霜霉病潛伏期也會(huì)大大縮短，此時(shí)更應(yīng)提前做好防治工作。本研究?jī)H開(kāi)展了赤霞珠品種葡萄霜霉病MDI的研究，后續(xù)將在其他釀酒葡萄品種上做進(jìn)一步驗(yàn)證，以提高利用MDI進(jìn)行病害防治預(yù)警的實(shí)用性。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-01-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFD1002502）;寧夏回族自治區(qū)科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2019BBF02013）

作者簡(jiǎn)介：杜 娟（1995-），女，河南漯河人，碩士研究生，主要從事生物防治與菌物資源利用研究。（E-mail）dujuan3548@163.com

通訊作者：顧沛雯，（E-mail）gupeiwen2019@nxu.edu.cn