TGF-β1/Smad3信號通路在電針抑制兔耳增生性瘢痕中的作用機(jī)制

鄭康華　　翁劍飛　　陳尚陽　　陳勇

[關(guān)鍵詞] 電針;增生性瘢痕;TGF-β1;Smad3

[中圖分類號] R363.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）15-0037-05

The mechanism of TGF-β1/Smad3 signaling pathway in the inhibition of hypertrophic scar of rabbit ears by electroacupuncture

ZHENG Kanghua1? ?WENG Jianfei1? ?CHEN Shangyang1? ?CHEN Yong2

1.The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou? ?350003， China; 2.College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou? ?350122， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of electroacupuncture in inhibiting hypertrophic scars in rabbit ears. Methods Sixteen of 64 New Zealand big-eared white rabbits were randomly selected as the blank group. The remaining rabbits were used to prepare hypertrophic scar rabbit ear models according to Li Huiyuan's literature. After the model was successfully established， they were randomly divided into the model group， electroacupuncture group and hand acupuncture group， with 16 in each group. The blank group and model group had no special treatment. The hand acupuncture group was given acupuncture stimulation. The electro-acupuncture group was given electric acupuncture stimulation based on the treatment of the hand acupuncture group. The changes in color， hardness， and thickness in each group are observed. Eight rabbits in each group were randomly selected and sacrificed on the 28th and 35th days after the operation. The scar tissue of rabbit ears was cut out. The HE staining， VG staining， scar hyperplasia index， and the changes of mRNA expression level detected by RT-PCR method in each group were observed. The changes after treatment in each group were compared. Results After one week and two weeks of acupuncture， compared with the model group， the number of fibroblasts and collagen fiber density in the scar of the electroacupuncture group decreased significantly in terms of HE staining and VG staining （P<0.05）. The arrangement of the dermis layer was relatively regular. In terms of scar hyperplasia index and mRNA protein expression of TGF-β1 and Smad3，the electroacupuncture group significantly decreased（P<0.05）. From the perspective of treatment time， the difference between the respective groups after one week and two weeks of acupuncture treatment was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture can significantly inhibit the proliferation of hypertrophic scars and reduce the mRNA protein expression of TGF-β1 and Smad3. Therefore， regulating the expression of TGF-β1/Smad3 signal pathway is its mechanism.

[Key words] Electroacupuncture; Hypertrophic scar; TGF-β1; Smad3

近年來，經(jīng)濟(jì)、社會的發(fā)展，使得人們對外在形象提出了更高的要求。在此環(huán)境下，醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)υ錾择：鄣难芯恳渤蔀榱藷衢T的課題。瘢痕增生是真皮組織創(chuàng)傷形成傷口后組織修復(fù)異常的結(jié)果，其組織學(xué)特征在于成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。隨著相關(guān)研究的不斷深入，轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）在瘢痕生成中的作用目前已被發(fā)現(xiàn)。創(chuàng)傷產(chǎn)生后，TGF-β的過量分泌與表達(dá)，是誘發(fā)瘢痕增生的主要因素[1-2]。Smad3蛋白作為其下游信號，充當(dāng)信號蛋白通路的作用，有助于促進(jìn)瘢痕形成，被應(yīng)用于介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β細(xì)胞反應(yīng)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，電針可以通過降低成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維蛋白含量而起到抑制增生性瘢痕的作用[4-5]。本研究運(yùn)用電針治療兔耳增生性瘢痕模型，通過觀察兔耳的大體形學(xué)態(tài)、組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞因子TGF-β1、Smad3的影響，來研究電針對兔耳增生性瘢痕抑制效果，分析其抑制作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

64只成年健康雄性大耳白兔，體重2.0～3.0 kg，來自于上海松江區(qū)松蓮實(shí)驗動物場。許可證號：SCXK（滬）2017-0008。在福建省中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗中心SPF級環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)，用普通飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度23～26℃，自然通風(fēng)。

1.2 模型制備

在適應(yīng)性飼養(yǎng)64只大耳白兔7 d后，隨機(jī)選擇16只作為空白組，剩余的兔子參照李薈元文獻(xiàn)制備增生性瘢痕兔耳模型[6-7]。手術(shù)前1 d，用電動剃毛刀將兔耳腹側(cè)的毛剔除干凈，并予術(shù)前8 h禁食。在動物手術(shù)室，完成常規(guī)消毒之后，用專用兔子固定器固定兔子，術(shù)前測量雙側(cè)兔耳皮膚厚度、硬度、比色卡值，并用事先制作好的內(nèi)徑1.0 cm×1.0 cm的正方形邊框印章標(biāo)記于兔耳腹側(cè)面，每個兔耳標(biāo)記4個1.0 cm×1.0 cm的正方形手術(shù)創(chuàng)面，各創(chuàng)面間距離>1.0 cm。然后用10%苯巴比妥鈉溶液按100 mg/kg劑量腹腔注射，然后將2%利多卡因注射液用于標(biāo)記線上的局部皮下麻醉，并沿標(biāo)記線切開皮膚。分離骨膜，保留軟骨，術(shù)后肌肉中注射青霉素（用量8萬U/kg），使傷口自然愈合。手術(shù)21 d后，傷口愈合，痂皮脫落，動物造模成功后，隨機(jī)分為模型組、電針組、手針組，每組各16只。

1.3 方法

1.3.1 空白組? 無特別處置，正常飼養(yǎng)。

1.3.2 模型組? 兔耳造模后無需處理，正常飼養(yǎng)。

1.3.3 手針組? 兔耳造模后，于每日下午15時，用0.3 mm×13.0 mm的針灸針在正方形瘢痕組織對角線延長線0.5 cm處沿正方形的邊線平行皮下透刺治療，共4針，留針15 min，連續(xù)5 d，間隔2 d，再進(jìn)入下一個療程，連續(xù)2個療程。

1.3.4? 電針組? 兔耳造模后，采用電針于每日下午15時對瘢痕進(jìn)行干預(yù)，采用0.3 mm×13 mm的針灸針在正方形瘢痕組織對角線延長線0.5 cm 處沿正方形的邊線平行皮下透刺治療，共4針。針刺后，連接電針儀的電極，用頻率為30/100 Hz，強(qiáng)度為3 mA，脈沖寬度為0.175 ms的連續(xù)波激勵脈沖電流。持續(xù)時間為15 min，連續(xù)5 d，間隔2 d，然后進(jìn)入下一個療程，連續(xù)2個療程。

1.4 標(biāo)本采集

于手術(shù)后第28、35天每組各隨機(jī)選取8只兔子處死，切開兔耳的瘢痕組織分為兩份進(jìn)行處理。一份用福爾馬林溶液固定標(biāo)本，石蠟包埋后切片，用于HE和VG染色觀察。另一份儲存在-80℃的液氮罐中，用于PCR檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大體形態(tài)觀察? 術(shù)后21 d后，于第21、28、35天，記錄瘢痕的厚度（用游標(biāo)卡尺測量）、硬度（用LX-A邵氏A 型硬度計測量）、傷口顏色（采用比色卡比較觀察）。

1.5.2 組織形態(tài)學(xué)觀察? ①HE染色，在光學(xué)顯微鏡下（×200次）觀察不同組瘢痕組織的成纖維細(xì)胞（NA）數(shù)量密度。②通過VG染色觀察不同組瘢痕組織膠原纖維（AA）的面積密度。③瘢痕增生指數(shù)（HI）=從瘢痕隆起的最高點(diǎn)到耳軟骨表面的垂直厚度/從瘢痕周圍正常皮膚的皮膚邊緣到軟骨表面的垂直厚度。

1.5.3 對TGF-β1和Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

1.5.3.1 提取總RNA? 在液氮中于-80℃取出兔耳增生性瘢痕組織塊，將其放入研缽中，添加液氮，然后用研磨機(jī)將其研磨成粉末（實(shí)驗前將研缽和研磨機(jī)在180°C烘烤4 h以滅活RNA）。取出組織粉，將其放入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol試劑，充分混合并溶解。加入200 μL氯仿，充分搖勻并混合，放入高速冷凍離心機(jī)中，選擇合適的轉(zhuǎn)子，將溫度設(shè)定為4°C，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 000 rpm，離心10 min后，離心管分為三層。上清液主要為RNA，取400 μL添加入相同體積的氯仿，充分搖勻并混合，然后在4°C下以12 000 rpm離心10 min。取上清液，加入等體積的異丙醇，并顛倒混合。在-20°C放置1 h后，在4°C以12 000 rpm離心15 min?？梢栽陔x心管底部看到白色沉淀，即RNA。棄去上清液，加入0.5 mL的75%乙醇，并在4°C下以10 000 rpm離心5 min。棄去上清液并短暫離心，用移液管吸干乙醇，并在真空下干燥2 min。加入20 μL DEPC水，在室溫下溶解5 min，充分混合并短暫離心以獲得RNA溶液。

1.5.3.2 基因定量? 設(shè)置波長參數(shù)在260 nm與280 nm，用微量移液器移液器吸取1 mL DEPC水，置于RNA質(zhì)量檢測器的探針上校對，然后將1 μL的總RNA吸入儀器的探針中，并使用分析軟件檢測。當(dāng)溶液的吸光度OD260/280比值為1.8～2.0時，根據(jù)光譜檢測計算出RNA濃度和純度。

1.5.3.3 去除基因組DNA反應(yīng)? ?根據(jù)表1在冰上準(zhǔn)備5 μL反應(yīng)系統(tǒng)。為了確保反應(yīng)溶液制備的準(zhǔn)確性，請根據(jù)反應(yīng)數(shù)+2制備預(yù)混液，并將其分配到每個反應(yīng)管中，然后添加RNA樣品。將以上試劑震蕩混勻后置入PCR擴(kuò)增儀中，并且在42℃下反應(yīng)2 min后將溫度降低至4℃。

1.5.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)? 按照表2于冰上進(jìn)行配制10 μL的反應(yīng)體系，同樣為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix。輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將以上試劑混勻后置入PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)15 min，再設(shè)定溫度為85℃，反應(yīng)5 s，然后降至4℃（如果不立即操作，可以將cDNA模板顛倒后放置在-20℃的冰箱中保存）。

1.5.3.5 Real Time PCR? ①按照表3于冰上進(jìn)行10 μL PCR反應(yīng)體系，按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix。引物序列見表4。②然后將將以上試劑混勻后放入PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。95℃預(yù)變性30 s，循環(huán)1次，再95℃變性5 s后，59℃退火、延伸30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔCt 法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：每個標(biāo)本重復(fù)3次，取平均Ct 值，以GAPDH為內(nèi)參照，ΔCt 值=靶基因GAPDH基因-Ct 值平均值;空白組為對照，ΔCt 值=待測靶基因ΔCt 值-空白組ΔCt 值?？瞻捉M的1，2-ΔΔCt 值為靶基因表達(dá)的倍數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。要借助于LSD法來對方差齊時的組間實(shí)施比較，若方差不齊，就利用Games-Howell進(jìn)行比較。檢驗的標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔耳瘢痕組織大體形態(tài)學(xué)改變

術(shù)后21 d后，兔耳腹側(cè)面?zhèn)隈：刍拘纬桑Y(jié)痂脫落，能夠明顯地觸摸到硬結(jié)，約為正常皮膚厚度的2倍，其增生范圍限制在原傷口內(nèi)。呈淡紅色改變，隨著時間的推移，瘢痕的色澤逐漸變淡，厚度變薄，硬度逐漸變軟。針刺1周和針刺2周后，與術(shù)后21 d比較，模型組、電針組、手針組的術(shù)后28 d和術(shù)后35 d在顏色、厚度和硬度均有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;電針組的顏色、厚度和硬度均明顯優(yōu)于模型組（P<0.05）;與手針組比較，電針組的顏色、厚度和硬度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;從治療時間上看，各自本組的針刺1周與針刺2周之間兩兩相比，顏色、厚度和硬度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

2.2 針刺對兔耳增生性瘢痕組織學(xué)改變

HE 染色見模型組真皮組織明顯增生變厚，增生瘢痕其組成大部分都是成纖維細(xì)胞、膠原纖維及新生血管等，其膠原排列沒有規(guī)律，呈現(xiàn)出結(jié)節(jié)狀和旋渦狀;電針組和手針組瘢痕體積縮小，顏色呈淡紅色、成纖維細(xì)胞數(shù)量縮減，排列相對規(guī)律。見封三圖6。VG染色顯示，模型組瘢痕組織中存在大量的粗大且排列不具規(guī)律的膠原纖維細(xì)胞以及膠原蛋白，不管是電針組還是手針組，其瘢痕體積都相對縮小，膠原纖維下降明顯。見封三圖7。

2.3 瘢痕增生指數(shù)HI

觀察各組在針刺1周（術(shù)后的28 d）和針刺2周（術(shù)后的35 d）瘢痕增生指數(shù)，與模型組比較，電針組瘢痕增生指數(shù)均明顯低于模型組（P<0.05）;與手針組比較，電針組瘢痕增生指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;從治療時間上看，各本組的針刺1周與針刺2周之間兩兩相比，瘢痕增生指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表6。

2.4 針刺對兔耳增生性瘢痕TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)影響

使用RT-PCR檢測兔耳瘢痕組織的TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)情況，與針刺1周（術(shù)后28 d）和針刺2周（術(shù)后35 d）比較結(jié)果見表7。與模型組相比，電針組和手針組TGF-β1、 Smad3的mRNA表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與手針組比較，電針組TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;從治療時間上看，各自本組的針刺1周與針刺2周之間兩兩相比，TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)中必經(jīng)的歷程，所有達(dá)到真皮層深部的創(chuàng)傷傷口都以瘢痕愈合為主[8]。增生性瘢痕是由于皮膚纖維母細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)所致的成纖維細(xì)胞過度增生的良性疾病[9]。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子。其廣泛存在于哺乳動物中。體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞都合成并分泌TGF-β受體[10]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種亞型，特別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β的三個亞型，在生物反應(yīng)中均廣泛參與，但各亞型中，TGF-β所占比例最高，達(dá)到90%以上，且具有極強(qiáng)的活性。TGF-β參與創(chuàng)傷傷口愈合的整個過程，它既可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時又分泌基質(zhì)蛋白抑制其降解過程。TGF-β是當(dāng)前研究中已知的最強(qiáng)的纖維化促進(jìn)因子。通過抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，同時促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原蛋白）的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，突顯了TGF-β/Smads信號通路與瘢痕之間的關(guān)系[11]。TGF-β1在瘢痕形成過程中的作用，主要體現(xiàn)在抗瘢痕方面。當(dāng)人體發(fā)生創(chuàng)傷后，機(jī)體TGF-β1的分泌量將隨即增加，細(xì)胞活性同樣可明顯提升，機(jī)體原有的新陳代謝平衡被打破，成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞基質(zhì)沉積促進(jìn)瘢痕增生。因此，增生性瘢痕是成纖維細(xì)胞過度增殖和膠原纖維過度沉積的結(jié)果。如果降低TGF-β1mRNA的表達(dá)，則可以達(dá)到抑制瘢痕形成的目的。Smad3蛋白是TGF-β1家族的下游信號蛋白。Smad3的主要功能是傳導(dǎo)信號并參與膠原蛋白的合成和收縮。因此，TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起著重要的作用[12]，Smad3可以介導(dǎo)TGF的生物學(xué)作用，并在創(chuàng)傷后組織修復(fù)和重建過程中，參與了瘢痕增生，并在增生性瘢痕中Smad3 mRNA的表達(dá)量升高。因此，抑制Smad3信號通路可以阻止TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，這不僅可以減少組織纖維化和病理性瘢痕的形成，而且可以延遲傷口的收縮[13-15]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，增生性瘢痕屬于中醫(yī)的“肉龜”“蟹足腫”“黃瓜癰”的范疇，關(guān)于瘢痕的病因病機(jī)認(rèn)識，一般認(rèn)為當(dāng)肌膚遭受金屬創(chuàng)傷、水火燙傷之后，邪毒與瘀血相結(jié)合，余毒未清，氣滯血瘀，搏結(jié)經(jīng)絡(luò)皮部而成[16-17]。在臨床運(yùn)用針刺治療增生性瘢痕大多收到良好的療效，因此，針刺增生性瘢痕具有解毒散結(jié)、行氣活血的功效。

實(shí)驗研究結(jié)果表明，與模型組比較，電針組的兔耳瘢痕組織色澤、厚度、硬度均明顯改善;HE和VG染色，真皮層厚度較薄，成纖維細(xì)胞數(shù)目和膠原纖維密度顯著降低，排列相對規(guī)則;PCR實(shí)驗結(jié)果顯示，電針組TGF-β1、Smad3蛋白mRNA表達(dá)量明顯減少（P<0.05）。但與手針組比較，電針組無論在瘢痕組織色澤、厚度、硬度方面、HE和VG染色還是PCR實(shí)驗檢測結(jié)果方面，電針組與手針組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。從治療時間影響方面，針刺治療1周和2周后，電針組和手針組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因此，經(jīng)電針治療后兔耳瘢痕組織中成纖維細(xì)胞、膠原纖維以及TGF-β1和其下游信號Smad3表達(dá)均有明顯抑制作用，推測電針調(diào)節(jié)兔耳增生性瘢痕的機(jī)制可能與TGF-β1、Smad3的表達(dá)受到抑制有關(guān)，隨著治療時間的增加，電針的效應(yīng)不斷衰弱，推測可能是選用連續(xù)波，針刺產(chǎn)生了耐受。本研究結(jié)果顯示電針在皮膚瘢痕動物模型中具有較好的治療效果及抗瘢痕作用，可能是通過調(diào)控TGF-β1/Smad 3信號通路表達(dá)起作用，此將為臨床應(yīng)用電針治療病理性瘢痕提供了一定的實(shí)驗基礎(chǔ)。針刺在治療瘢痕上具有安全、有效、費(fèi)用低的優(yōu)勢，今后將在臨床中廣泛推廣。

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（收稿日期：2020-10-28）