乳酸菌素片對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠腸道菌群的影響

詹揚(yáng)，萬(wàn)建華，李穎萌，楊妮，曹星辰，胡旭，劉文君

(江中藥業(yè)股份有限公司，南昌330004)

0 引言

腸道菌群是指分布在腸道的微生物菌群，它們與腸道系統(tǒng)共同構(gòu)成了腸道微生態(tài)，是維持腸道正常功能的基本保障[1]。腸道菌群失調(diào)是一些全身性疾病和消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的病因或相關(guān)因素，其與消化系統(tǒng)疾病的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)，長(zhǎng)期大量使用廣譜抗生素導(dǎo)致腸道菌群紊亂極易發(fā)生藥源性腹瀉[2]，稱(chēng)為抗生素相關(guān)性腹瀉（AAD），是抗生素使用常見(jiàn)的藥物副作用[2-3]。近年來(lái)，廣譜抗生素的大量使用導(dǎo)致AAD的發(fā)生率逐步增高，在接受抗生素治療的住院兒童約20%發(fā)生抗生素相關(guān)性腹瀉[4]。乳酸菌素是一種純?nèi)樗峋x產(chǎn)生的，將脫脂乳經(jīng)殺菌和真空濃縮后，再經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后干燥而制成的乳酸菌代謝產(chǎn)物混價(jià)粉狀物[5]，是改善腸道環(huán)境和調(diào)節(jié)腸道功能的傳統(tǒng)藥物，具有熱穩(wěn)定性和耐熱性，不受加工條件限制，安全性高，相比益生菌制劑其價(jià)格低廉易儲(chǔ)藏。隨著廣譜抗生素的應(yīng)用，近年來(lái)AAD的發(fā)生率呈逐漸增多的趨勢(shì)，其臨床表現(xiàn)輕重不一，可出現(xiàn)腹瀉、腸炎更甚者可引起死亡，同時(shí)使患者住院時(shí)間延長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，是臨床丞待解決的問(wèn)題。乳酸菌素片是常用的調(diào)節(jié)腸道功能的非處方藥物，本研究基于測(cè)序技術(shù)通過(guò)大鼠盲腸內(nèi)容物樣本的腸道微生物揭示出乳酸菌素通過(guò)干預(yù)腸道微生物達(dá)到治療腹瀉的作用，對(duì)引起腹瀉的腸道致病菌具有明顯的抑制作用，阻止病原菌侵襲，保護(hù)并促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，對(duì)于維持腸道正常微生態(tài)水平的有益菌具有明顯的增殖作用，為臨床抗生素應(yīng)用導(dǎo)致的腸道問(wèn)題提供有效的解決方案。

1 材料和方法

1.1 試劑

硫酸慶大霉素(含量≥590 U/mg，批號(hào)：20190122）,福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司；鹽酸林可霉素（含量≥90%，批號(hào)：20180818），河南新鄉(xiāng)華星藥廠(chǎng)；乳酸菌素片（批號(hào)：18059061，含量：按乳酸菌素計(jì)0.4 g/片），江中藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器

Secura225D-1CN型電子天秤，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；電子數(shù)顯卡尺（規(guī)格：0.01mm），南京蘇測(cè)計(jì)量?jī)x器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠40只，22～25 g，雄性，許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)，適應(yīng)性飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠腸道菌群失調(diào)腹瀉模型建立

SPF級(jí)雄性昆明小鼠40只，其中16只為正常組，剩余24只造模。正常組按0.5 mL/只的劑量灌胃無(wú)菌水，造模組灌胃濃度為0.4 g/mL的硫酸慶大霉素和鹽酸林可霉素各50%的復(fù)配液，0.5 mL/只，每日灌胃2次，連續(xù)6 d，小鼠糞便變得軟濕，呈黃綠色水樣便，則說(shuō)明造模成功[6-7]。

1.4.2 分組及給藥

根據(jù)排便情況選取16只造模成功的腹瀉小鼠隨機(jī)平分為模型組和乳酸菌素片組，乳酸菌素片組日給藥劑量（按乳酸菌素計(jì)）為：1.2 g/kg，藥片用研缽研碎后加無(wú)菌水溶解制成混懸液，藥液濃度為0.024 g/mL，灌胃量0.5 mL/次，每日灌胃2次?？瞻捉M和模型組灌胃無(wú)菌水0.5 m L/次，每日2次，共給藥5 d，第6天時(shí)，每組取8只小鼠收集盲腸內(nèi)容物暫存于液氮罐中備檢。

1.4.3 樣品采集

分別在造模結(jié)束后取正常組和造模組及給藥5 d后模型組和乳酸菌素片組的各8只小鼠盲腸內(nèi)容物立即置于液氮中保存。

1.4.4 一般情況觀(guān)察

小鼠每日稱(chēng)體質(zhì)量，由于腹瀉小鼠盲腸脹大明顯，所以給藥結(jié)束后將盲腸結(jié)扎后剪下稱(chēng)重，游標(biāo)卡尺測(cè)量盲腸長(zhǎng)度，然后于超凈工作臺(tái)中取完盲腸內(nèi)容物后，再將盲腸稱(chēng)重，通過(guò)2次稱(chēng)重差值計(jì)算盲腸內(nèi)容物重量[8]。

1.4.5 小鼠腸道微生物16SrRNA基因高通量測(cè)序

測(cè)定取0.2 g小鼠盲腸內(nèi)容物，進(jìn)行微生物群落總DNA抽提和16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控及優(yōu)化序列，優(yōu)化序列按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。然后，以O(shè)TU表格為基礎(chǔ)進(jìn)行物種分類(lèi)，生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)樣品各水平相對(duì)豐度進(jìn)行劃分；依據(jù)OTU表格數(shù)據(jù)進(jìn)行每個(gè)文庫(kù)多樣性分析，并利用R軟件（Version 3.4.2）繪制稀釋曲線(xiàn)、Rank-Abundance曲線(xiàn)、Chao1指數(shù)箱線(xiàn)圖以及Shannon指數(shù)箱線(xiàn)圖。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

各組數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正常組與模型組及模型組與給藥組比較均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異顯著。腸道菌群多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test檢驗(yàn)0.01＜P≤0.05標(biāo)記為*，0.001＜P≤0.01標(biāo)記為**，P≤0.001標(biāo)記為***。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠體重、排便狀況、盲腸內(nèi)容物指數(shù)等的差異性比較

與正常組相比，模型組給予抗生素造模6 d后，模型組小鼠采食量下降，被毛豎立，扎堆現(xiàn)象嚴(yán)重，肛周黏附軟濕糞便，應(yīng)激排便呈黃綠色水樣便，少許夾有血絲，個(gè)別出現(xiàn)脫肛，正常組未見(jiàn)明顯異常。已知小鼠腹瀉狀態(tài)下其盲腸重量、盲腸指數(shù)和盲腸內(nèi)容物指數(shù)與正常組相比顯著增大，模型組與正常組相比盲腸長(zhǎng)度、體重、盲腸重量等顯著增大（P＜0.001），結(jié)果見(jiàn)表1，說(shuō)明抗生素腹瀉模型造模成功[8]。

表1 造模6 d后，模型組與正常組相比一般情況比較(n=8，x±s)

給藥5 d后，模型組小鼠糞便仍呈輕微濕軟狀態(tài)，成形性較差，乳酸菌素片組的小鼠糞便成形性及硬度明顯優(yōu)于模型組，同時(shí)，小鼠的盲腸重量、盲腸指數(shù)和盲腸內(nèi)容物指數(shù)和模型組相比顯著減?。≒＜0.01、P＜0.001，P=0.0001/0.00003/0.0040），結(jié)果見(jiàn)表2，表明乳酸菌素組給藥5 d后可明顯改善腹瀉小鼠腸道狀態(tài)。

表2 給藥5 d后，模型組與乳酸菌素片組相比一般情況比較(n=8，x±s)

2.2 乳酸菌素片給藥5 d后對(duì)小鼠腸道微生物多樣性的影響分析

2.2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

由圖1（a）可知，隨著測(cè)序深度的增加，觀(guān)測(cè)物種的指數(shù)曲線(xiàn)趨于平緩，說(shuō)明當(dāng)前測(cè)序深度足以發(fā)現(xiàn)各盲腸內(nèi)容物樣本中的大部分物種。同時(shí)，從圖1（b）中反映物種豐富度及均勻度的Rank-Abundance曲線(xiàn)可以看出，隨著OUT等級(jí)的增加，曲線(xiàn)愈加平坦并在橫軸的跨度也越來(lái)越大，說(shuō)明樣品中物種的均勻度和相對(duì)豐度都達(dá)到了很高的水平。

圖1 樣品多樣性指數(shù)分析

2.2.2 Pan/Core物種分析

Pan/Core物種分析能判斷樣本量是否充足并且評(píng)估樣品中物種豐富度和核心物種數(shù)。根據(jù)Pan/Core物種曲線(xiàn)是否平緩，從而評(píng)估測(cè)序樣本量是否足夠。圖2（a）、圖2（b）中隨著樣本量增加，曲線(xiàn)趨于平滑，說(shuō)明各組樣本量充足。灌胃純水5 d后模型組的曲線(xiàn)位于最下端，其總物種豐富度和核心物種數(shù)量最低。給藥組總物種豐富度和核心物種數(shù)也較低，但相比模型組有所升高。

圖2 各組腸道菌群α多樣性變化

2.2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可采用群落多樣性指數(shù)包括Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)表示。造模結(jié)束后和乳酸菌素片給藥5 d后對(duì)模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3，造模結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組Simpson指數(shù)顯著升高且Shannon指數(shù)顯著降低（0.3281±0.26635vs0.05601±0.01865，2.3129±1.2085 vs 3.9018±0.1564，P＜0.05，P=0.0354/0.0130），說(shuō)明抗生素致腹瀉模型小鼠腸道菌群豐富度和群落中個(gè)體分配上的均勻性都顯著降低，抗生素致腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠模型造模成功，由于個(gè)體差異性，模型組造模6 d后腸道群落多樣性指數(shù)差異較大，停止抗生素干預(yù)5 d后模型組腸道群落多樣性指數(shù)的差異性逐漸減少，說(shuō)明小鼠腸道內(nèi)菌群自身在不斷調(diào)整。乳酸菌素片組與模型組比較，Simpson指數(shù)顯著降低且Shannon指數(shù)顯著升高（0.4918±0.0606vs0.2098±0.03812，1.1219±0.12825 vs 2.2167±0.2098，P＜0.0001，P=9.211×10-8/1.432×10-8），說(shuō)明乳酸菌素能顯著提高腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠的腸道菌群多樣性。

圖3 模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成分析

PCA得分圖（見(jiàn)圖4）中PC1和PC2對(duì)總體方差解釋的百分比分別為46.49%和24.81%，PCoA得分圖（見(jiàn)圖5）中PC1和PC2對(duì)總體方差解釋的百分比分別為41.6%和24.6%，模型組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)可以完全分開(kāi)，模型組樣本點(diǎn)差異較大，結(jié)果和Alpha多樣性結(jié)果吻合，表明抗生素致小鼠腸道菌群紊亂模型造模成功。模型組樣本點(diǎn)與乳酸菌素片組樣本點(diǎn)完全分開(kāi)，說(shuō)明乳酸菌素片組腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)與組成相比模型組發(fā)生了較大變化。

圖4 PCA分析圖

圖5 PCoA分析圖

2.2.5 乳酸菌素片對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，在種水平下各組樣本中豐度前10的物種組成情況見(jiàn)圖6，活潑瘤胃球菌屬（unclassified_g_[Ruminococcus]_Gnavus_group）、梭狀芽孢桿菌_ND 2（Clostridium_sp._ND2）、生酸擬桿菌（Bacteroides_acidifaciens）、未分類(lèi)的類(lèi)桿菌（unclassified_g_Bacteroides）、不可培養(yǎng)的另枝菌（uncultured_bacterium_g_Alistipes）、腸球菌屬（Enterococcus_casseliflavus_g_Enterococcus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia_mannitolilytica）、志 賀 氏 菌 屬（Escherichia_coil_Escherichia-Shigella）、未分類(lèi)的乳酸桿菌屬（unclassified_g_Lactobacillus）、不可培養(yǎng)的無(wú)毒梭菌（uncultured_bacterium_g_[Clostridium]_innocuum_group）、不可培養(yǎng)的未分類(lèi)的鼠桿菌科（uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae），乳酸菌素片組腸道菌群組成與模型組有較大差異。

圖6 種水平下各組樣本腸道菌群的相對(duì)豐度

2.2.6 腸道菌群物種差異分析

根據(jù)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌素片組與模型組的腸道菌群多樣性具有較大差異，乳酸菌素片的干預(yù)使得抗生素致腹瀉小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成發(fā)生了改變，為了比較乳酸菌素片干預(yù)后造成腸道微生物多樣性差異的關(guān)鍵菌屬，進(jìn)一步在屬水平下比較乳酸菌素片組與模型組豐度前10的物種差異性，組間差異性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，乳酸菌素片組與模型組比較有害菌豐度顯著降低（(62.06±15.95)%vs(27.78±11.43)%，(7.062±4.134)%vs(1.497±0.5112)%，P＜0.01，P=0.0031/0.0015）的有兩個(gè)，包括活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）、無(wú) 害 梭 菌 組 屬（[Clostridium]_Innocuum_group），有益菌豐度顯著增加（(0.01927±0.048)%vs(14.58±10.3)%，(1.265±2.936)%vs(3.203±1.366)%，P＜0.05，P=0.0014/0.0177）的有兩個(gè)，包括腸球菌屬（Enterococcus）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）。腸道正常菌屬豐度顯著增加（(1.108±2.229)%vs(3.339±3.041)%，(0.1032±0.1816)%vs(3.024±3.97)%，(0.3366±0.1864)%vs(1.561±1.666)%，P＜0.05，P=0.0230/0.0065/0.0240）的有3個(gè)，包括布勞特氏菌屬（Blautia）、無(wú)嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、未 分 類(lèi) 的 毛 螺 菌 屬（unclassified_f_Lachnospiraceae）。

圖7 乳酸菌素片組與模型組屬水平下關(guān)鍵菌屬差異性比較

3 結(jié)果與討論

本研究采用抗生素干預(yù)小鼠腸道使其菌群組成嚴(yán)重破壞，模擬臨床抗生素致腹瀉患者的腸道微環(huán)境，在給予乳酸菌素5 d后，乳酸菌素片組的小鼠腹瀉狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，進(jìn)一步采用16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)乳酸菌素對(duì)AAD小鼠的作用做了菌群水平的系統(tǒng)解析和關(guān)鍵菌屬的差異性比較。結(jié)果顯示，乳酸菌素片組給藥5 d后AAD小鼠的腸道菌群多樣性及物種豐度和模型組相比已有了顯著升高，其腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成與模型組相比有較大差異，進(jìn)一步的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析可知，剛造模結(jié)束的模型組和自然恢復(fù)5 d后模型組之間也存在較大差異，說(shuō)明停止抗生素干預(yù)后小鼠腸道菌群變化過(guò)程也較快，進(jìn)一步物種的組成分析及豐度前10的物種差異分析可知，乳酸菌素片組的活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）和無(wú)害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）相比模型組極顯著性降低，其中無(wú)害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）是引起抗生素相關(guān)性腹瀉的典型致病菌[9-10]?；顫娏鑫盖蚓鷮俸投喾N腸道疾病相關(guān)如炎性腸病[11]、克羅恩腸炎[12]、憩室炎[13]等。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有益生功效的代謝產(chǎn)物稱(chēng)為后生元[14]，前期已有研究證明乳酸菌在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生過(guò)氧化氫，同時(shí)可產(chǎn)生氧化性中間產(chǎn)物，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖[15]，本文首次在腸道菌群的角度證明乳酸菌素對(duì)活潑瘤胃球菌屬和無(wú)害梭菌屬具有明顯的抑制作用。

乳酸菌素片組相比模型組的腸球菌屬（Enterococcus）、無(wú)嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、布勞特氏菌屬（Blautia）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae）都有顯著升高（P＜0.05）。腸球菌屬（Enterococcus）[16]是在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)廣泛存在的兼性厭氧型腸道菌，包括糞腸球菌、鳥(niǎo)腸球菌、希臘腸球菌等多種類(lèi)型，是人類(lèi)及動(dòng)物體內(nèi)正常菌群的重要組成部分。毛螺菌屬（Lachnospiraceae）為腸道有益菌，可將復(fù)雜的多糖降解為短鏈脂肪酸，如乙酸丁酸和丙酸，從而為宿主提供能量[17]。無(wú)嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）和布勞特氏菌屬（Blautia）均屬于厚壁菌門(mén)的腸道常見(jiàn)菌。由此可見(jiàn)，乳酸菌素可快速調(diào)整抗生素致腹瀉小鼠的腸道菌群紊亂結(jié)構(gòu)，使菌群的多樣性增加，抑制或殺滅典型腹瀉相關(guān)菌屬，增加腸道有益菌和正常菌豐度。

本研究側(cè)重于乳酸菌素對(duì)腸道菌群紊亂小鼠腸道菌生長(zhǎng)增殖的影響，對(duì)于具體作用機(jī)制研究不足，16SrRNA基因分析主要是對(duì)基因高變區(qū)進(jìn)行分析測(cè)序，通常是屬水平，屬于較高的分類(lèi)學(xué)水平，無(wú)法有效鑒定到種水平，對(duì)于具體功能研究有較大限制。