基于SRAP標記半楓荷天然種群的遺傳多樣性分析

葉興狀， 張明珠， 劉益鵬， 文國衛(wèi)， 賴文峰， 范輝華， 張國防， 劉 寶，①

(1. 福建農(nóng)林大學林學院， 福建 福州 350002； 2. 福建省林業(yè)科學研究院特色資源研究所， 福建 福州 350012)

由于人類活動對生態(tài)環(huán)境的破壞日益嚴重[1]，加之全球氣候變暖[2]，許多植物的分布區(qū)域銳減，由連續(xù)分布演變成間斷分布，進而成為瀕危植物[3]。因瀕危植物自身適應水平較低，加之繁殖障礙和地理隔離，瀕危植物間的基因交流越來越困難，有的甚至出現(xiàn)瓶頸效應，進而導致其遺傳多樣性喪失，甚至物種滅絕[4-5]。研究瀕危植物的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)有助于瀕危植物的保護與開發(fā)利用。

半楓荷(SemiliquidambarcathayensisChang)(2n=32)隸屬于蕈樹科(Altingiaceae)，為稀有種、國家二級重點保護野生植物，零星散狀分布于中國長江以南山區(qū)，具有重要的科研價值[6-7]。Wu等[7]利用分子標記證明半楓荷為楓香樹屬(LiquidambarLinn.)和蕈樹屬(AltingiaNoronha)的屬間天然雜交種。半楓荷具有較高的觀賞價值，是中國南方為數(shù)不多的彩葉樹種，春、秋兩季葉片部分變?yōu)樽霞t色、紅色，且同株有2～5種葉型，具有良好的園林綠化應用前景。半楓荷還是藥用植物，為傳統(tǒng)苗藥，其根具有祛風除濕、鎮(zhèn)痛消腫和抑制病毒性肝炎抗原活性的功效[8]。由于半楓荷對生長環(huán)境要求苛刻，有效種子少，在群落內(nèi)常為非優(yōu)勢種，在競爭光熱資源時常處于弱勢地位，再加上人們過度采挖半楓荷根等原因，導致其遺傳資源大量流失，瀕臨滅絕[9]。目前，僅田曉明等[10]和葉興狀等[11]進行了半楓荷轉(zhuǎn)錄組測序等分子標記準備工作，亟需對半楓荷群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，這對其遺傳資源保護策略的制定具有重要意義。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標記是顯性標記，具有簡便、高效、重復性好等優(yōu)點[12]。已有研究結(jié)果[12-14]顯示：在研究對象基因型未知的情況下，采用SRAP標記技術(shù)研究其遺傳多樣性有效可行。Li等[14]利用SRAP標記對半楓荷近緣的金縷梅科(Hamamelidaceae)植物四藥門花〔Loropetalumsubcordatum(Benth.) Oliv.〕的遺傳多樣性進行了研究，并為其制定了保護策略。

鑒于此，本研究采用SRAP標記分析來自福建、湖南、廣東、江西和廣西的半楓荷17個天然種群154個樣株的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，探討半楓荷的分布特征對其遺傳變異的影響，以期為半楓荷遺傳資源保護及開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2018年3月至5月對半楓荷的天然分布區(qū)進行全面調(diào)查，按照居群間地理距離大于10 km、株間距大于10 m的標準，對分布于福建、湖南、廣東、江西和廣西的17個天然種群進行采樣，各種群的具體地理分布信息見表1。其中，分布于福建長汀、永定、清流、延平、邵武、南靖和周寧7個種群的半楓荷株數(shù)較少。每個種群各樣株采集100 g無病蟲害的當年生嫩葉，剪下后立即放入冰盒，帶回實驗室后將嫩葉平均分成3份，擦拭干凈后用錫箔紙包好，然后用液氮冷凍30 min，最后放入-80 ℃冰箱保存，用于提取基因組DNA。

表1 半楓荷17個天然種群的地理分布信息

1.2 方法

參考Murray等[15]的方法從半楓荷葉中提取基因組DNA，使用Nano-200微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)測定DNA的濃度和質(zhì)量，使用質(zhì)量體積分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶的完整性。使用T100梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行擴增。參考董蒙蒙[16]31的方法，從225對SRAP引物組合中篩選出10對多態(tài)性豐富、條帶清晰的引物組合用于半楓荷154個樣株的遺傳多樣性分析。

PCR反應體系包括：100 ng·μL-1DNA 1.0 μL，2×TaqPCR StarMix with Loading Dye混合液12.5 μL，5 mol·L-1上游和下游引物各1.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性45 s、35 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，7個循環(huán)；94 ℃變性45 s、35 ℃退火1 min、52 ℃延伸1 min，28個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR反應結(jié)束后，取10 μL擴增產(chǎn)物，加入1×TBE電泳緩沖液，在質(zhì)量體積分數(shù)30%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后參考董蒙蒙[16]32的方法銀染。使用YGD-Ⅱ醫(yī)用觀片燈(冀州市宏光康復器械廠)觀察條帶，并用DSC-RX10M4數(shù)碼相機(日本SONY公司)拍照、保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計電泳圖中100～2 000 bp間的條帶，某一位點上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，其中，模糊條帶與同區(qū)間清晰條帶比對，將數(shù)據(jù)輸入EXCEL 2010軟件構(gòu)建原始的“1”、“0”矩陣。

利用POPGEN1.32軟件[17]計算觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、多態(tài)性條帶百分比、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)。使用MEGA5.0軟件[18]繪制半楓荷17個天然種群和154個樣株的聚類圖。采用GenAlEx 6.5軟件[19]進行Mantel檢驗，檢驗半楓荷種群間遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，并用該軟件進行分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，計算種群間的遺傳分化系數(shù)和基因流以及種群內(nèi)和種群間遺傳變異的貢獻率。采用STRUCTURE2.3.4軟件[20]分析遺傳結(jié)構(gòu)，分組數(shù)(K)設(shè)置為1～17，每個K值重復運算10次，500 000次馬爾科夫鏈蒙特卡羅(MC)重復之后進行100 000次burn-in。使用STRUCTURE Harvester確定最佳K值。使用CLUMPP2.0軟件[21]將10次運算結(jié)果合并，并采用Distruct1.1軟件[22]將半楓荷群體遺傳結(jié)構(gòu)以圖形方式可視化輸出。

2 結(jié)果和分析

2.1 擴增結(jié)果及遺傳多樣性分析

從225對SRAP引物中篩選出10對用于半楓荷154個樣株基因組DNA的擴增，10對SRAP引物的序列及擴增結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：共得到235個條帶，每對引物擴增的條帶數(shù)為18～28，平均每對引物擴增出23.5個條帶，其中多態(tài)性條帶179個，平均多態(tài)性條帶百分比為77.2%。

表2 用于半楓荷154個樣株基因組DNA擴增的引物序列及擴增結(jié)果

基于SRAP引物擴增結(jié)果，半楓荷17個天然種群的遺傳多樣性分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：基于SRAP引物檢測出的半楓荷17個天然種群的多態(tài)性條帶數(shù)為32～167，均值為113.6，多態(tài)性條帶百分比(PPB)為17.9%～93.3%，均值為63.5%；觀察等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)分別為1.2～1.9和1.2～1.6，均值分別為1.6和1.5；Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)(I)分別為0.089 4～0.354 4和0.123 9～0.521 0，均值分別為0.250 4和0.366 2，其中，福建連城種群的Nei ’ s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon ’ s多態(tài)性信息指數(shù)均最高，分別為0.354 4和0.521 0。

表3 基于SRAP引物擴增結(jié)果半楓荷17個天然種群的遺傳多樣性分析

基于Nei’s遺傳多樣性指數(shù)對半楓荷17個天然種群的遺傳多樣性進行排序，從大到小依次為福建連城種群、福建沙縣種群、廣東平遠種群、福建武平種群、福建順昌種群、江西樂安種群、湖南江華種群、廣西融水種群、福建德化種群、江西大余種群、福建清流種群、福建南靖種群、福建清流種群、福建永定種群、福建延平種群、福建邵武種群、福建長汀種群和福建周寧種群。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明：半楓荷17個天然種群間的遺傳分化系數(shù)為0.241，種群間基因流為1.579，種群內(nèi)遺傳變異的貢獻率高達75.95%，而種群間遺傳變異的貢獻率僅占24.05%，且種群間和種群內(nèi)的差異達到極顯著(P<0.001)水平。說明半楓荷遺傳多樣性主要分布在種群內(nèi)，種群間僅出現(xiàn)一定程度的遺傳分化。

Mantel檢驗結(jié)果表明：半楓荷17個天然種群的遺傳距離和地理距離間無顯著相關(guān)性(r=0.068，P=0.350)，表明地理隔離不是導致半楓荷遺傳變異高的主要因子。

Neighbor-joining聚類圖(圖1)顯示：在遺傳距離0.18處，半楓荷17個天然種群劃分為Ⅰ和Ⅱ 2個集群。集群Ⅰ包括福建的德化、連城、延平、沙縣、清流、南靖、周寧、邵武和順昌種群，江西的樂安和大余種群，廣東平遠種群以及廣西融水種群共13個種群，集群Ⅱ包括湖南江華種群以及福建的長汀、永定和武平種群共4個種群。在遺傳距離0.11處，集群Ⅰ可進一步劃分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd 4個亞群，其中，亞群Ⅰa包括福建的德化和連城種群，江西的樂安和大余種群以及廣東平遠種群，亞群Ⅰb包括福建的延平、沙縣和清流種群，亞群Ⅰc包括福建的南靖和周寧種群，亞群Ⅰd包括福建的邵武和順昌種群以及廣西融水種群；集群Ⅱ可進一步劃分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞群，其中，湖南江華種群單獨構(gòu)成亞群Ⅱa，亞群Ⅱb包括福建的長汀、永定和武平種群。

UPGMA聚類圖(圖2)顯示：在遺傳距離0.65處，半楓荷17個天然種群的154個樣株分為2個集群，其中，湖南江華種群中16個樣株單獨聚為集群Ⅱ，其他138個樣株共同聚為集群Ⅰ。在遺傳距離0.30處，集群Ⅰ劃分為6個亞群，其中，廣東平遠種群中大部分樣株聚為亞群Ⅰc；Neighbor-joining聚類圖中福建的長汀、永定和武平種群屬于集群Ⅱ，而UPGMA聚類圖中這3個種群的樣株在集群Ⅰ中，基本聚在亞群Ⅰe。

DH: 福建德化Dehua of Fujian; LC: 福建連城Liancheng of Fujian; LA: 江西樂安Le’an of Jiangxi; DY: 江西大余Dayu of Jiangxi; PY: 廣東平遠Pingyuan of Guangdong; YP: 福建延平Y(jié)anping of Fujian; SX: 福建沙縣Shaxian of Fujian; QL: 福建清流Qingliu of Fujian; NJ: 福建南靖Nanjing of Fujian; ZN: 福建周寧Zhouning of Fujian; SW: 福建邵武Shaowu of Fujian; RS: 廣西融水Rongshui of Guangxi; SC: 福建順昌Shunchang of Fujian; JH: 湖南江華Jianghua of Hunan; CT: 福建長汀Changting of Fujian; YD: 福建永定Yongding of Fujian; WP: 福建武平Wuping of Fujian.圖1 半楓荷17個天然種群的Neighbor-joining聚類圖Fig. 1 Neighbor-joining dendrogram of 17 natural populations of Semiliquidambar cathayensis Chang

使用STRUCTURE軟件檢測供試半楓荷17個天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖3)顯示：K=2時，ΔK值最大；K=7時，ΔK值次之(圖3-A)。K=7時，半楓荷的遺傳結(jié)構(gòu)聚類較清晰(圖3-B)，說明半楓荷17個天然種群可先劃分為2大集群，再進一步細分為7個亞群。

綜合Neighbor-joining聚類圖、UPGMA聚類圖和STRUCTURE分析結(jié)果，可將半楓荷17個天然種群先劃分為2個集群，然后在Neighbor-joining聚類圖的劃分基礎(chǔ)上，將亞群Ⅱa中的廣東平遠種群單獨劃分為1個亞群，共7個亞群。

DH： 福建德化Dehua of Fujian； LA： 江西樂安Le’an of Jiangxi； DY： 江西大余Dayu of Jiangxi； LC： 福建連城Liancheng of Fujian； CT： 福建長汀Changting of Fujian； YD： 福建永定Yongding of Fujian； WP： 福建武平Wuping of Fujian； NJ： 福建南靖Nanjing of Fujian； ZN： 福建周寧Zhouning of Fujian； SX： 福建沙縣Shaxian of Fujian； QL： 福建清流Qingliu of Fujian； YP： 福建延平Y(jié)anping of Fujian； SC： 福建順昌Shunchang of Fujian； SW： 福建邵武Shaowu of Fujian； RS： 廣西融水Rongshui of Guangxi； JH： 湖南江華Jianghua of Hunan； PY： 廣東平遠Pingyuan of Guangdong.圖3 半楓荷17個天然種群的分組(A)和遺傳結(jié)構(gòu)(B)分析Fig. 3 Analyses on cluster (A) and genetic structure (B) of 17 natural populations of Semiliquidambar cathayensis Chang

3 討論和結(jié)論

3.1 半楓荷天然種群的遺傳多樣性

通常情況下，瀕危植物由于瓶頸效應、近親繁殖、奠基者效應和遺傳漂變等原因，其遺傳多樣性較低，如細果秤錘樹(SinojackiamicrocarpaC. T. Chen et G. Y. Li)〔Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.100 7，Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)(I)為0.165 8〕[23]和水青樹(TetracentronsinenseOliv.)(H值為0.076，I值為0.112)[24]。本研究中，半楓荷天然種群具有較高水平的遺傳多樣性(H值為0.250 4，I值為0.366 2)。且半楓荷其他近緣種的遺傳多樣性也普遍較高，如銀縷梅〔Parrotiasubaequalis(H. T. Chang) R. M. Hao et H. T. Wei〕(H值為0.203 1，I值為0.313 2)[25]和檵木〔Loropetalumchinense(R. Br.) Oliv.〕(H值為0.65)[26]。蕈樹科是超薔薇類(Superosids)植物的基部類群，半楓荷遺傳多樣性較高可能是蕈樹科植物作為一個古老樹種系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果，也可能是半楓荷為屬間天然雜交種，還可能與第四紀冰期半楓荷種群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、現(xiàn)存種群為其避難所殘跡有關(guān)[6-7]。遺傳多樣性可能與自然環(huán)境中種群大小或密度等變量有關(guān)，但難以定量測定這些變量對遺傳多樣性的影響。福建的連城、武平、沙縣和順昌種群以及廣東平遠種群的遺傳多樣性較高且種群中半楓荷株數(shù)多，其中，福建的連城、武平、沙縣和順昌種群主要分布在高海拔、陡坡密林處，生境破壞程度較小，推測人為干擾較少是這4個種群遺傳多樣性較高的重要原因。

半楓荷生境總體受人為干擾較大，其天然種群呈現(xiàn)破碎化間斷分布，種群規(guī)模通常較小，甚至部分為孤立木，迫使半楓荷自交繁殖。近親繁殖會導致瀕危植物種群數(shù)量減少，降低其遺傳多樣性[27]。半楓荷在群落內(nèi)常為非優(yōu)勢種，在競爭光熱資源時常處于弱勢，加之對光熱的需求苛刻，不利于其生殖生長和種群規(guī)模的擴大，進而影響其遺傳多樣性。

3.2 半楓荷種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

半楓荷遺傳變異主要存在于種群內(nèi)(貢獻率75.95%)，種群間的遺傳變異相對較小(貢獻率24.05%)。但其近緣植物四藥門花[14]僅15%的變異來自種群內(nèi)，說明半楓荷種群內(nèi)的遺傳變異較為豐富，具有較豐富的可開發(fā)利用的遺傳資源。半楓荷屬于混合交配的繁育系統(tǒng)，但其種群間遺傳分化系數(shù)為0.241，說明其種群內(nèi)遺傳分化水平較高，可能與該種對生境要求特殊以及分布區(qū)的地形地貌有關(guān)。半楓荷零星分布于武夷山脈、戴云山脈、南嶺山脈、雩山山脈、羅霄山脈、十萬大山、雪峰山脈、苗嶺、大瑤山脈及黎母山脈，多生長在空氣濕度大的溝谷、密林(陽坡)及竹林中，各種群被走向多樣的高山阻隔。K=2～7時，半楓荷17個種群遺傳結(jié)構(gòu)的劃分均存在較大的雜合性，K=2時，雖然ΔK值最大，卻不能顯示清晰的遺傳結(jié)構(gòu)，K=7時，各種群間的遺傳分化更明顯，因此，這17個種群可劃分為7個基因庫。半楓荷全基因組雜合率為2.93%，重復序列約占68.87%(未發(fā)表數(shù)據(jù))，表明半楓荷遺傳背景復雜、雜合性高，與半楓荷為楓香樹屬與蕈樹屬天然雜交種的結(jié)論相吻合[7]。植物繁育類型是植物種群遺傳變異模式的決定性因子[28]。異交物種的遺傳分化系數(shù)平均值為0.19[29]，而自交物種的遺傳分化系數(shù)平均值為0.414 0[30]，表明半楓荷很可能屬于兼性自交的繁育系統(tǒng)，這與調(diào)查中發(fā)現(xiàn)半楓荷多數(shù)植株結(jié)實率低相吻合，且半楓荷極可能是自交親和。Schmitt等[31]研究半楓荷同科植物北美楓香(LiquidambarstyracifluaLinn.)的自花不育特征，認為自交會導致果實中種子數(shù)極大減少。因此，半楓荷結(jié)實率低可能由于自交率較高和屬間天然雜交親和性低所致。本研究中，半楓荷種群間基因流為1.579，大于1，說明種群間基因交流強度適中，也說明種群間沒有顯著的遺傳分化，因此，半楓荷天然種群的遺傳多樣性水平對遺傳漂變不敏感。

綜合Neighbor-joining聚類圖、UPGMA聚類圖和STRUCTURE分析結(jié)果，半楓荷17個天然種群先劃分為Ⅰ和Ⅱ 2個集群，集群Ⅰ進一步劃分為5個亞群，其中，亞群Ⅰa包括福建的德化和連城種群以及江西的樂安和大余種群，亞群Ⅰb僅包括廣東平遠種群，亞群Ⅰc包括福建的延平、沙縣和清流種群，亞群Ⅰd包括福建的南靖和周寧種群，亞群Ⅰe包括福建的邵武和順昌種群以及廣西融水種群；集群Ⅱ進一步劃分為2個亞群，其中，湖南江華種群單獨構(gòu)成亞群Ⅱa，亞群Ⅱb包括福建的長汀、永定和武平種群。雖然采樣不均勻時，STUCTURE軟件計算結(jié)果的可靠性可能會降低[32]，但采用3種方法對半楓荷17個天然種群遺傳結(jié)構(gòu)的劃分結(jié)果基本一致，只是在部分樣株劃分上有差異，因此，本研究對半楓荷17個天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)劃分結(jié)果可信度較高。值得注意的是，盡管廣西融水種群與福建的邵武和順昌種群在地理位置上距離很遠，但聚為同一亞群，并且廣西融水種群和福建順昌種群的遺傳多樣性較高，這可能是由于這3個種群來自同一祖先。STRUCTURE分析結(jié)果顯示：廣西融水種群以及福建的邵武和順昌種群來自同一個基因池，也證明這3個種群的祖先可能相同?？梢娋垲惤Y(jié)果與地理位置有一定相關(guān)性，但并不顯著，同時Mantel檢驗結(jié)果也表明半楓荷種群間遺傳距離和地理距離無顯著相關(guān)性。

本研究中，10對SRAP引物對半楓荷154個樣株共擴增出235個條帶，179個條帶具有多態(tài)性，平均多態(tài)性條帶百分比為77.2%，說明本研究可靠性較高。但由于海南、廣西、貴州和湖南等省、自治區(qū)半楓荷的具體分布信息未能完全掌握，加之本研究中7個半楓荷種群的半楓荷株數(shù)較少，導致本研究取樣存在不足，對研究結(jié)論的準確性造成一定的影響。作者所在團隊將在半楓荷全基因組解析完成后開展半楓荷基因組重測序工作，以期全面解析其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和譜系地理，彌補本研究的不足。

3.3 半楓荷遺傳資源保護

外業(yè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，半楓荷生境漸趨惡化、破碎化日益嚴重、結(jié)實周期長短不一、種子空粒較多、大多數(shù)半楓荷周圍未發(fā)現(xiàn)小苗、且多為孤立木，結(jié)合本研究結(jié)果，雖然半楓荷遺傳多樣性較高，但自交概率較高，種群衰退趨勢明顯，半楓荷天然種群亟需保護與復壯。具體建議如下：首先，應加快完成遷地保護，盡可能收集所有種群的種子，保存其遺傳資源完整性。本研究團隊已在福建省順昌縣建立半楓荷種質(zhì)資源庫，接下來還將進一步擴大種質(zhì)資源收集范圍。其次，應立即實施就地保護，保護原生境。遺傳多樣性較高的福建的連城、沙縣、武平和順昌種群，湖南江華種群，廣西融水種群以及廣東平遠種群應給予優(yōu)先保護。此外，福建德化、長汀和清流等小種群應嚴格保護(如采取建立保護小區(qū)、封山育林及回歸定植等措施)，禁止一切破壞行為。