熒光免疫層析法不同時間檢測糖化血紅蛋白的結(jié)果分析

肖中華

江西省撫州市樂安縣人民醫(yī)院檢驗科，江西撫州 344300

隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率及患病率逐年升高，嚴重威脅我國人民的健康。糖化血紅蛋白(HbA1c)可反映受檢者檢測前120 d內(nèi)的平均血糖水平，能準確反映糖尿病患者長期的血糖控制水平，且不受采血時間、是否空腹、是否使用胰島素等因素干擾。在美國、歐盟、澳洲及日本等國家和地區(qū)已將HbA1c列為糖尿病的診斷和監(jiān)測指標，在我國其被推薦用于糖尿病診斷及診斷標準的相關(guān)研究[1-2]。同時也有研究報道，將HbA1c與其他項目聯(lián)合檢測用于相關(guān)疾病的診斷、鑒別與療效評估具有較高的應(yīng)用價值[3-4]。熒光免疫層析法作為HbA1c檢測方法之一，因其融合了膠體金免疫層析技術(shù)的定量檢測方法，具有操作簡單、攜帶方便、檢測速度快等優(yōu)點[5-6]，已被當作床旁檢測(POCT)項目廣泛應(yīng)用于各基層醫(yī)院實驗室及病房，但其不需要專業(yè)人員操作就可以得出檢測結(jié)果，容易因操作不規(guī)范，從而影響檢測結(jié)果的準確性。筆者通過熒光免疫層析法對不同HbA1c水平標本進行檢測，檢測過程中對各步驟設(shè)置不同時間，發(fā)現(xiàn)不同HbA1c水平標本加入標本稀釋液后混合作用不同時間的檢測結(jié)果，以及標本稀釋混合液加入檢測板后在不同時間進行檢測的結(jié)果均存在一定的差異，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 (1)質(zhì)控品2份：水平1(批號191018，靶值5.0%)和水平2(批號191018，靶值9.7%)質(zhì)控品均由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司提供。(2)收集15份糖尿病患者乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血標本(2～8 ℃保存7 d內(nèi)的患者標本，標本的HbA1c水平取值于按標本按試劑盒說明書標準操作程序檢測2次的均值)，其中HbA1c<6%的標本5份(設(shè)為HbA1c低值組)，HbA1c為6%～10%的標本5份(設(shè)為HbA1c中值組)，HbA1c>10%的標本5份(設(shè)為HbA1c高值組)。

1.2儀器與試劑 萬孚飛測Ⅲplus免疫熒光檢測儀、HbA1c檢測試劑盒(熒光免疫層析法，批號：W20714606A)均購自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。

1.3檢測方法 (1)方法A：嚴格按照HbA1c檢測試劑盒說明書進行標準操作，取試劑、標本在室溫下平衡，取10 μL血液標本加入標本稀釋液中混勻作用1 min后，取75 μL標本稀釋混合液加入檢測板，5 min后立即進行檢測。依次對定值質(zhì)控品水平1、水平2及15份不同HbA1c水平的全血標本進行檢測，并記錄結(jié)果作為對照。(2)方法B：將上述試劑盒說明書標準操作步驟中的標本與稀釋液作用時間，設(shè)置為不同時間再分別按作用時間吸樣加入檢測板作用5 min后立即檢測，記錄結(jié)果，并與標準操作(方法A)檢測結(jié)果進行比較。(3)方法C：按說明書標準操作步驟制備標本，與稀釋液混合作用1 min的標本混合液加入檢測板，設(shè)置不同檢測時間進行檢測，記錄結(jié)果，并與標準操作(方法A)檢測結(jié)果進行比較。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。不同步驟作用時間之間檢測結(jié)果采用單變量方差分析法進行比較；不同HbA1c水平分組之間的檢測結(jié)果先與樣品水平標示值比較算出偏倚值(取其絕對值)，再將偏倚值進行單變量方差分析法比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1方法A與方法B檢測不同水平HbA1c的結(jié)果比較 (1)標本加入稀釋液混合作用1 min (標準操作)檢測結(jié)果與混合作用3、5 min檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與混合作用10～60 min檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)質(zhì)控品水平1與HbA1c低值組、HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)質(zhì)控品水平2與HbA1c低值組、HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)HbA1c低值組與HbA1c中值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(5) HbA1c中值組與HbA1c高值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體作用時間及檢測結(jié)果見表1，HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組和不同水平質(zhì)控品偏倚值結(jié)果見表2。

表1 各標本分別用方法A和方法B檢測的HbA1c水平(%)

表2 方法B檢測HbA1c水平與樣品水平標示值比較的偏倚值(%)

2.2方法A與方法C檢測不同水平HbA1c的結(jié)果比較 (1) 標本稀釋混合液加入檢測板后5 min (標準操作)檢測結(jié)果與加入檢測板后10、15、20 min檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與加入檢測板后25、30、60 min檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)質(zhì)控品水平1與HbA1c低值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與HbA1c中值組、HbA1c高值組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)質(zhì)控品水平2與HbA1c中值組、HbA1c高值組偏倚值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與HbA1c低值組偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組間偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(5) 質(zhì)控品水平1與水平2 偏倚值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體檢測時間及檢測結(jié)果見表3，HbA1c低值組、HbA1c中值組、HbA1c高值組和不同水平質(zhì)控品偏倚值結(jié)果見表4。

表3 各標本分別用方法A和方法C檢測HbA1c水平(%)

表4 方法C檢測HbA1c水平與樣品水平標示值比較的偏倚值(%)

3 討 論

熒光免疫層析法是利用熒光免疫技術(shù)，結(jié)合層析法和免疫法的特點，采用夾心法檢測HbA1c在人體血液中的百分比。檢測原理：標本中的HbA1c、血紅蛋白(Hb)分別與包被在硝酸纖維素膜上的熒光標記HbA1c單克隆抗體、熒光標記Hb單克隆抗體結(jié)合，在層析作用下反應(yīng)復合物沿著硝酸纖維素膜向前擴散，被固定在硝酸纖維素膜檢測線上包被的HbA1c抗體、Hb抗體結(jié)合，血液標本中的HbA1c抗原、血紅蛋白(Hb)抗原水平與熒光信號強度呈正相關(guān)，通過熒光檢測儀檢測熒光信號強弱計算得出HbA1c占Hb的比值[3-6]。

大量的文獻對國內(nèi)HbA1c的檢測方法和分析儀器進行比較[6-11]，并對HbA1c的檢測現(xiàn)狀進行了闡述，其中高效液相色譜法被認為是檢測HbA1c最穩(wěn)定和準確的參考方法。有研究者用其他方法與高效液相色譜法進行對比分析，其中曹東林等[5]和ANG等[6]都對熒光免疫層析法與高效液相色譜法進行了比較，發(fā)現(xiàn)二者檢測結(jié)果有較好的一致性。

本研究結(jié)果顯示，熒光免疫層析法在檢測全血標本HbA1c的過程中，標本與標本稀釋液混合作用時間在1～5 min內(nèi)進行檢測，對檢測結(jié)果無影響(P>0.05)，作用時間延長至10 min以后，HbA1c水平越高的標本隨著標本稀釋液作用時間的延長，檢測結(jié)果逐漸降低，與標準操作(1 min)檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這可能與標本稀釋液中含有十二烷基硫酸鈉(SDS)有關(guān)，SDS是一種陰離子表面活性劑，可使紅細胞膜崩解，釋放Hb(含HbA1c)，當其與Hb作用一定時間后，可能也會改變Hb的構(gòu)象，其抗原性也相應(yīng)發(fā)生改變，但真正的原因有待進一步做相關(guān)研究來證實。有相關(guān)研究報道，一定水平的SDS與Hb作用后，可使Hb變性，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨著SDS溶液水平的增加，蛋白質(zhì)去折疊的程度加大，構(gòu)型發(fā)生進一步變化[10-11]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，標本稀釋混合液加入熒光免疫層析檢測板后作用 5～20 min內(nèi)進行檢測，對檢測結(jié)果無影響(P>0.05)，檢測時間延長至25 min以后，HbA1c水平越高的標本隨著檢測時間的延長，檢測結(jié)果也逐漸降低，與標準操作(5 min)檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這應(yīng)該與熒光強度隨時間的延長而自然衰減有關(guān)。

綜上所述，熒光免疫層析法以其不需要昂貴設(shè)備、操作簡單、攜帶方便、檢測速度快等優(yōu)點為基層醫(yī)院開展HbA1c檢測帶來了便利，但在檢測過程中應(yīng)嚴格遵守操作標準，并在合理的時間內(nèi)完成檢測，否則可能造成檢測結(jié)果不準確，對臨床疾病的診斷和治療無參考價值，甚至誤導臨床，延誤患者病情，嚴重者可能危及患者生命。