4種檢測(cè)技術(shù)對(duì)艾滋病合并肺結(jié)核的診斷效能比較*

蔣 玲，錢(qián)春芳，李同心，彭羽靜

重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心：1.結(jié)核二科；2.實(shí)驗(yàn)室；3.結(jié)核四科，重慶 400000

艾滋病使人體喪失免疫功能，其患者極易合并各種機(jī)會(huì)性感染。肺結(jié)核是艾滋病患者最常合并的機(jī)會(huì)性感染之一，是艾滋病患者疾病進(jìn)展的重要影響因素，也是艾滋病患者死亡的重要原因。艾滋病合并肺結(jié)核臨床表現(xiàn)不典型，且可能還合并多種其他機(jī)會(huì)性感染，使病情更加復(fù)雜，因此，艾滋病合并肺結(jié)核的診斷相對(duì)較困難。目前，病原學(xué)檢測(cè)仍是艾滋病合并肺結(jié)核診斷的主要依據(jù)，常用的檢測(cè)技術(shù)有痰涂片抗酸染色鏡檢(簡(jiǎn)稱“涂片法”)、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱“MGIT960培養(yǎng)法”)、RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)法(簡(jiǎn)稱“TB-SAT法”)、Gene-Xpert MTB/RIF檢測(cè)法(簡(jiǎn)稱“Gene-Xpert法”)。本研究采用以上4種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)對(duì)艾滋病合并肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，比較4種檢測(cè)技術(shù)的診斷效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1-12月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心感染科收治的107例通過(guò)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢查和臨床綜合分析診斷為艾滋病合并肺結(jié)核的患者為研究對(duì)象，其中男86例，女21例；平均年齡(47.12±15.21)歲。所有痰標(biāo)本采集前未使用過(guò)抗結(jié)核藥物，所有痰標(biāo)本均進(jìn)行了涂片法、MGIT960培養(yǎng)法、Gene-Xpert法、TB-SAT法4種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)檢驗(yàn)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《國(guó)家肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS288-2017》[1]《臨床結(jié)核病學(xué)(第2版)》[2]《結(jié)核菌/艾滋病病毒雙重感染防治政策指南——適用于國(guó)家規(guī)范和利益攸關(guān)方》[3]和《HIV合并結(jié)核分枝桿菌感染診治專家共識(shí)》[4]，結(jié)合本研究的全部檢測(cè)方法，對(duì)艾滋病確診患者進(jìn)行結(jié)核病診斷，如判定為活動(dòng)性肺結(jié)核再進(jìn)一步確定為臨床診斷病例或確診病例。

1.3儀器與試劑 抗酸染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)及MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)管購(gòu)自美國(guó)BD公司；RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒(TB-SAT試劑)購(gòu)自上海仁度生物科技有限公司；Gene-Xpert檢測(cè)儀及試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司；H37RV結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4檢測(cè)方法 收集107例艾滋病合并肺結(jié)核患者的晨痰標(biāo)本5～6 mL于無(wú)菌痰杯中送檢，每份標(biāo)本同時(shí)采用涂片法、MGIT960培養(yǎng)法、TB-SAT法和Gene-Xpert法檢測(cè)。

1.4.1涂片法 采用萋-尼抗酸染色，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》(簡(jiǎn)稱“規(guī)程”)[5]進(jìn)行涂片法檢測(cè)和結(jié)果判讀。

1.4.2MGIT960培養(yǎng)法及菌種鑒定 嚴(yán)格按照 BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，吸取0.5 mL痰標(biāo)本加入50 mL圓底離心管內(nèi)，再加入1～2 mL前處理液，振蕩消化15 min，加入40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，離心(3 000×g離心18 min)，棄上清液，加1 mL的PBS進(jìn)行重懸沉淀，取0.1 mL接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)管內(nèi)，放入BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4.3TB-SAT法 嚴(yán)格按照TB-SAT試劑說(shuō)明書(shū)操作，取1 mL痰標(biāo)本采用13 000 r/min離心5 min，棄上清液，再用1 mL無(wú)菌生理鹽水洗滌一次后加入50 μL TB裂解液重懸，超聲(功率300 W)處理15 min。取2 μL處理后的標(biāo)本加入含30 μL擴(kuò)增檢測(cè)液的微量反應(yīng)管中，將微量反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，再置于42 ℃保溫5 min，同時(shí)將反應(yīng)酶預(yù)熱至42 ℃，最后向每支反應(yīng)管中加入10 μL反應(yīng)酶，迅速混勻并轉(zhuǎn)至熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序：熒光通道設(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集每分鐘1次，共檢測(cè)40次。陽(yáng)性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(檢測(cè)時(shí)間)<40 min。每次檢測(cè)都必須做陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.4Gene-Xpert法 取1 mL標(biāo)本加入前處理管內(nèi)，視標(biāo)本性狀加入2倍標(biāo)本處理試劑(SR)，渦旋振蕩15～30 s，靜置15 min；取2 mL處理后標(biāo)本加入Gene-Xpert的反應(yīng)盒，自動(dòng)進(jìn)行PCR檢測(cè)所需的3個(gè)步驟(標(biāo)本核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè))。采用Gene-Xpert檢測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoBde 81bp利福平核心區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否發(fā)生基因突變。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kappa檢驗(yàn)將涂片法、TB-SAT法、Gene-Xpert與MGIT960培養(yǎng)法進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，當(dāng)Kappa≤0.4時(shí)，表示一致性較差，當(dāng)0.40.8時(shí)，表示一致性良好。

2 結(jié) 果

2.14種方法檢測(cè)結(jié)果 107例患者痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行4種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率由低到高依次為涂片法、TB-SAT法、Gene-Xpert法、MGIT960培養(yǎng)法，分別為30.84%(33/107)、35.51%(38/107)、49.53%(53/107)、51.40%(55/107)。TB-SAT法陽(yáng)性率(35.51%)雖高于涂片法陽(yáng)性率(30.84%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.764，P=0.382)，MGIT960培養(yǎng)法陽(yáng)性率(51.40%)高于涂片法陽(yáng)性率(30.84%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.246，P=0.001)；MGIT960培養(yǎng)法陽(yáng)性率(51.40%)高于TB-SAT法陽(yáng)性率(35.51%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.496，P=0.019)；Gene-Xpert法陽(yáng)性率(49.53%)低于MGIT960培養(yǎng)法陽(yáng)性率(51.40%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.075，P=0.078)；Gene-Xpert法陽(yáng)性率(49.53%)高于TB-SAT法陽(yáng)性率(35.51%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.302，P=0.038)。

2.2檢測(cè)結(jié)果一致性分析 以MGIT960培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)涂片法、TB-SAT、Gene-Xpert法與MGIT960培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性，3種檢驗(yàn)方法結(jié)果與MGIT960培養(yǎng)法檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)表1。通過(guò)Kappa值判定3種檢驗(yàn)方法與MGIT960培養(yǎng)法的一致性：涂片法Kappa值為0.445，兩者一致性中等；TB-SAT法Kappa值為0.648，兩者具有較高的一致性；GeneXpert法Kappa值為0.851，兩者一致性良好。見(jiàn)表2。

表1 其他3種檢測(cè)方法與MGIT960培養(yǎng)法檢驗(yàn)結(jié)果(n)

表2 以MGIT960培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)判定其他3種檢測(cè)方法的診斷效能

3 討 論

2019年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，全球范圍約有1 000萬(wàn)例結(jié)核病新發(fā)病例，其中8.6%為人類免疫缺陷病毒(HIV)陽(yáng)性患者，且約25.1萬(wàn)例艾滋病患者相關(guān)死因是由于結(jié)核病所致[6]。中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，HIV感染者的艾滋病患者中結(jié)核病的患病率分別為7.2%和22.8%[7]。與單純的結(jié)核病診斷相比，艾滋病合并結(jié)核病患者診斷相對(duì)困難，容易誤診、漏診和延遲診斷。因此，世界衛(wèi)生組織推薦對(duì)于艾滋病患者中疑似有結(jié)核分枝桿菌感染者要使用包括分子生物學(xué)診斷工具、培養(yǎng)和影像診斷在內(nèi)的所有手段，縮短艾滋病合并結(jié)核病的診斷時(shí)間，以降低患者病死率[4]。

MGIT960培養(yǎng)法及菌種鑒定為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，還能進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)；在本研究中，MGIT960培養(yǎng)法陽(yáng)性率高于其他3種方法，是臨床診斷中不可或缺的檢驗(yàn)技術(shù)，但該技術(shù)操作繁瑣，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，艾滋病患者因免疫力低下，病情進(jìn)展迅速導(dǎo)致不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)高，若僅采用此方法診斷，容易造成艾滋病合并肺結(jié)核患者的延遲診斷。

涂片法簡(jiǎn)單便捷，成本低，易普及，目前，仍是國(guó)內(nèi)結(jié)核病最主要的初篩方法和隨訪時(shí)監(jiān)測(cè)療效手段[8-9]。但涂片法陽(yáng)性率低，本研究中，艾滋病合并肺結(jié)核患者中涂片法檢測(cè)陽(yáng)性率為30.84%，難以滿足臨床診斷的需求。若僅采用涂片法進(jìn)行艾滋病合并肺結(jié)核的診斷，容易造成艾滋病合并肺結(jié)核患者漏診。

TB-SAT法的操作簡(jiǎn)單，2 h內(nèi)可獲得檢測(cè)結(jié)果[10]，對(duì)于RNA轉(zhuǎn)錄活躍的病原體，是一項(xiàng)較好的診斷指標(biāo)[11]，且可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌有無(wú)生命力，試驗(yàn)過(guò)程中交叉污染較少，可為結(jié)核病患者的治療效果提供參考。本研究中，TB-SAT法陽(yáng)性率為35.51%，高于王靜等[12]報(bào)道的陽(yáng)性率(7.6%)；靈敏度為67.27%，低于安東成等[13]報(bào)道的靈敏度(88.1%)。該方法與MGIT960培養(yǎng)法具有較高的一致性，推薦用于診斷艾滋病合并肺結(jié)核，同時(shí)可采用此方法評(píng)價(jià)患者的治療效果。

Gene-Xpert法將MGIT960培養(yǎng)至少需要3周才能完成的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)時(shí)間縮短為2 h，且該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)室人員容易掌握，整個(gè)實(shí)驗(yàn)手動(dòng)操作時(shí)間不超過(guò)5 min，整個(gè)檢測(cè)在一個(gè)密閉的環(huán)境中進(jìn)行，對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員有較好的保護(hù)[14]。本研究中，Gene-Xpert法靈敏度較涂片法、TB-SAT法都高，與MGIT960培養(yǎng)法具有良好的一致性，可以用來(lái)代替MGIT960培養(yǎng)法診斷艾滋病合并肺結(jié)核。

綜上所述，筆者建議在診斷艾滋病合并肺結(jié)核時(shí)優(yōu)先選用Gene-Xpert法；可選用TB-SAT法進(jìn)行該類患者診斷及治療效果的評(píng)估；選用MGIT960培養(yǎng)法做菌種鑒定，便于進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，明確該類患者是否耐藥；條件有限的基層實(shí)驗(yàn)室仍可選用涂片法進(jìn)行初篩和療效評(píng)估。