miR-181b-3p在胃癌患者血清中的表達(dá)及其靶基因預(yù)測

陳木龍，陳紅虹

廣東省梅州市第二中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東梅州 514011

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其病死率在全球癌癥中位居第二位，每年全球新增患者約100萬，中國占42%，全球死亡人數(shù)約80萬，中國占35%[1]。胃癌Ⅰ期患者5年生存率可達(dá)90%，而Ⅳ期患者5年生存率僅為5%[2]。目前，對胃癌的早期診斷及治療方案的選擇均缺少有指導(dǎo)意義的特異性指標(biāo)，從而導(dǎo)致胃癌的5年生存率并無明顯改善。因此，探索能反映胃癌發(fā)生、發(fā)展情況的標(biāo)志物，對早期防治胃癌和改善胃癌預(yù)后具有重要意義。微小RNA(miRNA) 是長度為19～24個核苷酸的內(nèi)源性短鏈RNA，在個體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖及凋亡等過程中起重要調(diào)控作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，人類30%以上的蛋白質(zhì)編碼基因可能受miRNA的調(diào)控，大約50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域，廣泛參與腫瘤發(fā)生，因此，miRNA可以作為臨床輔助診斷腫瘤和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[3]。miR-181b-3p在不同類型腫瘤中的研究均有報(bào)道，例如miR-181b-3p在非小細(xì)胞肺癌[4]、星形細(xì)胞瘤[5]中低表達(dá)，但在乳腺癌[6]、骨肉瘤[7]中高表達(dá)。本研究通過分析胃癌患者血清中的miR-181b-3p相對表達(dá)水平，以及診斷效能，為尋找有效的胃癌診斷生物標(biāo)志物提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年6月至2020年6月收治的胃癌患者35例作為研究組，其中男23例，女12例；平均年齡(57.51±6.84)歲。同期健康志愿者45例作為對照組，其中男25例，女20例；平均年齡(56.71±6.87)歲。胃癌患者均經(jīng)胃鏡病理檢查確診，且均為初診；近3個月未規(guī)律服用過抑酸藥、胃黏膜保護(hù)劑、非甾體類藥物、抗菌藥物。

1.2試劑 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。miR-181b-3p和內(nèi)參U6引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3檢測方法 采集所有研究對象空腹外周靜脈血5 mL，在2 h內(nèi)離心15 min(3 000 r/min、室溫)，分離出血清作為標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取血清，加入Trizol進(jìn)行裂解?？俁NA提取根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行。測定所提取的RNA水平后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用RT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。U6為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-181b-3p的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清中miR-181b-3p相對表達(dá)水平比較 對照組與研究組miR-181b-3p相對表達(dá)水平分別為1.01±0.31、1.89±0.66，研究組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.943，P<0.05)。

2.2不同特征胃癌患者血清中miR-181b-3p的相對表達(dá)水平 不同性別、年齡和腫瘤最大徑胃癌患者血清中miR-181b-3p相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.906、P=0.372，t=0.251、P=0.803，t=0.397、P=0.694)。未/低分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者血清中miR-181b-3p相對表達(dá)水平明顯高于中/高分化程度、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.509、P<0.001，t=3.080、P=0.004，t=2.641、P=0.013)。見表1。

表1 不同特征胃癌患者血清中miR-181b-3p的相對表達(dá)水平

2.3血清miR-181b-3p檢測在胃癌中的診斷價(jià)值 血清miR-181b-3p診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.886，95%可信區(qū)間(95%CI)為0.815～0.956，靈敏度為68.8%，特異度為91.1%，最佳截?cái)嘀禐?.597。見圖1。

圖1 血清miR-181b-3p診斷胃癌的ROC曲線

2.4miR-181b-3p靶基因的預(yù)測 使用數(shù)據(jù)庫miRDB、miRWalk、TargetScan和DIANA TOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-181b-3p的靶基因，預(yù)測的個數(shù)分別為743、2 061、4 995和1 092個，然后用Veney 2.1.0軟件繪制韋恩圖，結(jié)果顯示4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集有95個，占各預(yù)測軟件預(yù)測靶基因總和的1.5%。運(yùn)用Cytoscape_v3.6.1軟件，繪制出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明，miR-181b-3p的靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系較復(fù)雜，有20個編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系較穩(wěn)定。見圖2、3。

圖2 miR-181b-3p靶基因預(yù)測的韋恩圖

圖3 miR-181b-3p預(yù)測靶基因所編碼蛋白質(zhì)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

隨著胃癌診治技術(shù)的不斷發(fā)展，胃癌的治療效果已經(jīng)有所提升，但是胃癌患者5年生存率依然很低，主要原因是大多數(shù)胃癌患者在晚期時才被診斷，錯過了最佳診治時期。因此，提高胃癌早期診斷率具有重要意義，探索有效的診斷指標(biāo)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

近年來，隨著各種高通量測序平臺用于分析全基因組miRNA基因的表達(dá)，有研究者指出，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，并有望成為新的具有巨大潛力的腫瘤生物標(biāo)志物[8]。miRNA可通過形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體與靶基因miRNA的3′端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的翻譯和表達(dá)[9]。一般情況下，單個miRNA可以調(diào)控多個靶基因的表達(dá)，既可能調(diào)控癌基因，也可能調(diào)控抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

多種miRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如miR-155通過靶向SMAD2、FADD抑制胃癌細(xì)胞凋亡[10]；miR-218可通過SLIT/ROBO1信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移[11]；miR-21通過下調(diào)抑癌基因RECK的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲[12]。miR-181家族也是受到眾多關(guān)注的miRNA之一，目前已知的miR-181家族重要成員有miR-181a、miR-181b-3p、miR-181c和miRNA-181d。在胃癌的相關(guān)研究中，安娟等[13]指出胃癌患者血清中的miR-181d相對表達(dá)水平明顯高于健康對照者，且可能通過PDCD4發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用；譚玲等[14]在細(xì)胞水平證實(shí)miR-181c可能參與幽門螺桿菌(Hp)相關(guān)胃癌的發(fā)生、發(fā)展；GUO等[15]在細(xì)胞水平揭示miR-181b-3p能通過調(diào)節(jié)TIMP-3的表達(dá)，調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲；ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn)miR-181a能通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因KLF6促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，與健康志愿者相比，胃癌患者血清中miR-181b-3p呈高表達(dá)。同時，通過對胃癌患者特征分析表明，不同性別、年齡、腫瘤最大徑患者的miR-181b-3p相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度和TNM分期患者的miR-181b-3p相對表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明，miR-181b-3p 可能作為癌基因參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，這也從臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA在胃癌發(fā)展過程中的作用。為了進(jìn)一步探討血清miR-181b-3p檢測在胃癌中的診斷效能，本研究繪制ROC曲線確定miR-181b-3p檢測的最佳截?cái)嘀禐?.597，表明miR-181b-3p對胃癌具有一定的診斷價(jià)值。但是，miR-181b-3p與胃癌的作用機(jī)制尚不清楚，本研究通過結(jié)合多個靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-181b-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測及相應(yīng)的蛋白相互作用分析，為后續(xù)的作用機(jī)制研究提供切入點(diǎn)。鄧珊珊等[17]的研究證實(shí)細(xì)胞基質(zhì)蛋白3(MATR3)參與調(diào)控病毒RNA的核輸出、病毒基因組的穩(wěn)定性和表達(dá)。SUN等[18]和SONG等[19]分別指出miR-193a-5p和miR-107通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8(CDK8)加速胃癌的惡化。本研究繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，MATR3和CDK8均與miR-181b-3p存在相互關(guān)系，因此，推測miR-181b-3p可能通過MATR3或CDK8參與胃癌的發(fā)生，這一推測尚需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，胃癌患者血清miR-181b-3p相對表達(dá)水平與胃癌有密切聯(lián)系，對胃癌的診斷和機(jī)制研究具有重要意義。