桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

李育林，蔡秋瑩，湯曉月，周林樺，任冬霞，呂凡，李云*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041）

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）為木犀科（Oleaceae）木犀屬植物，又名九里香、山桂、金栗等。在傳統(tǒng)飲食文化中，桂花被添加到酒[1-2]、茶[3]以及糕點(diǎn)中用以增加食品風(fēng)味。桂花作為我國(guó)特有的珍貴純天然香料，從中提取的桂花露[4]、桂花浸膏及精油[5-6]被應(yīng)用到化妝品和香水的生產(chǎn)。

黃酮類化合物作為一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]，存在于大多數(shù)的水果、蔬菜、茶以及眾多植物的根莖葉及花中。眾多研究表明，黃酮類化合物具有抑制自由基的氧化反應(yīng)、降低腫瘤及心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等多種生理功能[8-10]。劉哲慧等[11]對(duì)水芹總黃酮的研究表明，對(duì)于由雞紅細(xì)胞引起的小鼠血清中的溶血素水平下降，水芹總黃酮具有一定的提高作用。諸多研究證明，桂花提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、鎮(zhèn)痛抗炎等生理功能[12-15]。李?yuàn)檻浀萚16]從日香桂根莖中分離得到一個(gè)新的化學(xué)成分（GH-0521），二甲苯耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)和醋酸扭體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明該化學(xué)成分具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。黃酮類化合物是一種天然的免疫調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[17]，提高抗體效價(jià)[18]，使免疫器官指數(shù)增加，增強(qiáng)非特異性免疫[19]，改善機(jī)體免疫系統(tǒng)。曹柏營(yíng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)藤本豆豆莢總黃酮表現(xiàn)出呈劑量依賴性的增強(qiáng)巨噬細(xì)胞系統(tǒng)活性的能力，對(duì)小鼠的非特異性免疫具有免疫增強(qiáng)作用。本課題組前期對(duì)桂花提取物中黃酮類化合物的體內(nèi)外抗氧化活性進(jìn)行了研究[21]，未涉及黃酮類化合物的定性研究。本文對(duì)桂花提取物中黃酮類化合物進(jìn)行成分鑒定，為桂花資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）：品種為日香桂，采摘于成都市溫江區(qū)萬(wàn)畝桂花產(chǎn)業(yè)園；桂花提取物osthin：由四川大學(xué)華西藥學(xué)院黃靜教授課題組提供，常溫（25℃）下呈半固體，保存于-20℃冰箱。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蘆?。兌取?8%）：北京索萊寶科技有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純）：德國(guó)CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XA-1型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：江蘇姜堰市銀河實(shí)驗(yàn)儀器廠；HSY-SP電熱恒溫水浴箱：北京市永光明醫(yī)療器械廠；GZD-D400-BS-II電熱恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BSA223S電子天平：德國(guó)Sartorius公司；EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科儀器有限公司；Multiskan GO自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀：美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司；索氏提取器：四川蜀玻有限公司；TGL-16MS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TYXH-I漩渦振蕩器：上海汗諾儀器有限公司；Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 桂花提取物的提取

新鮮桂花采摘后立即在80℃下烘干，粉碎，過(guò)40目篩，常溫（25℃）避光保存。采用乙醇回流法提取，提取條件：按料液比1∶40（g/mL）加入濃度為80%的乙醇，回流提取時(shí)間為3 h，提取溫度為70℃。所得提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于65℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇后濃縮，使用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得桂花提取物。

1.3.2 桂花提取物中黃酮類化合物含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，30%乙醇溶解，配制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5 mL 加入到 10 mL 的容量瓶，各加入0.4 mL的5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，混勻，用30%乙醇定容，搖勻，10 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)（X）為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，縱坐標(biāo)（Y）為吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。

取桂花提取物原液、10倍稀釋液、20倍稀釋液和50倍稀釋液各1 mL置于10 mL容量瓶中，按照上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測(cè)定其吸光度，選擇吸光度在上述標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度A范圍內(nèi)的樣品，按照回歸方程計(jì)算出桂花提取物中黃酮類化合物的含量。

1.3.3 桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

1.3.3.1 預(yù)處理過(guò)程

將桂花提取物離心 10 min（13 000 r/min，4 ℃），用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶，-80℃下保存。

稱取15 mg桂花提取物osthin，加入1 mL的甲醇：水（7∶3，體積比），加入兩個(gè)小鋼珠，在-20℃放置 2 min預(yù)冷，放入研磨機(jī)（60Hz，2min），超聲輔助提取 30 min，-20℃靜置20 min后，離心10 min（13 000 r/min，4℃），用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到液相色譜（liquid chromatography，LC）進(jìn)樣小瓶，-80℃下保存。

1.3.3.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度見(jiàn)表1。流速0.4 mL/min，柱溫45℃，進(jìn)樣體積 2 μL。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

離子源是電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)為毛細(xì)管電壓+3、-2 kV，樣品錐孔電壓40 V，源偏移電壓80 V，源溫度120℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速800 L/h，錐孔氣流速50 L/h，質(zhì)量掃描范圍m/z50～100。

1.3.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

原始數(shù)據(jù)的采集使用UNIFI1.8.1軟件。在進(jìn)行模式識(shí)別之前，原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v2.3軟件（Nonlinear Dynamics Newcastle UK）進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化，其主要參數(shù)為母離子質(zhì)量偏差5ppm；子離子質(zhì)量偏差10ppm；子離子強(qiáng)度偏差閾值5%。將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并成一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣表?；衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片以及同位素分布，使用 The Human Metabolome Database（HMDB）、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)蘆丁的濃度和吸光度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，得到濃度和吸光度的回歸方程為Y=0.347X+0.045 8，（R2=0.999）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 桂花提取物中黃酮類化合物的濃度

桂花提取物10倍稀釋液的吸光度為0.17，通過(guò)回歸方程得出桂花提取物中黃酮類化合物的濃度為3.58 mg/mL。

2.3 桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

基峰圖（base peak chromatogram，BPC）是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中最強(qiáng)離子的強(qiáng)度連續(xù)描繪得到的圖譜。桂花提取物正負(fù)離子模式的BPC見(jiàn)圖2和圖3，桂花提取物中黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息詳見(jiàn)表2。

表2 桂花提取物中黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息Table 2 Data information table of flavonoids in Osmanthus fragrans Lour.extract

圖2 桂花提取物正離子模式的BPC圖Fig.2 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract in positive ion mode

圖3 桂花提取物負(fù)離子模式的BPC圖Fig.3 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract negative ion mode

由圖2、圖3和表2可知，通過(guò)與HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比，將所測(cè)物質(zhì)的理論質(zhì)荷比（m/z）與實(shí)際測(cè)得的該物質(zhì)的質(zhì)荷比進(jìn)行比較，得分＞40分，一般為此類化合物?？赡艿狞S酮類化合物有358種，表2列出了得分在前10的黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息，桂花提取物中miconioside B、egonol gentiobiosidev、camellianin A得分較高。

桂花提取物osthin正負(fù)離子模式的BPC見(jiàn)圖4和圖5。桂花提取物osthin中黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息詳見(jiàn)表3。

圖4 桂花提取物osthin正離子模式的BPC圖Fig.4 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin positive ion mode

圖5 桂花提取物osthin負(fù)離子模式的BPC圖Fig.5 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin negative ion mode

表3 桂花提取物osthin中黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息Table 3 Data information sheet of flavonoids in osmanthus extract osthin

由圖4、圖5和表3可知，通過(guò)與HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比，將所測(cè)物質(zhì)的理論質(zhì)荷比（m/z）與實(shí)際測(cè)得的該物質(zhì)的質(zhì)荷比進(jìn)行比較，得分＞40分，一般為此類化合物。桂花提取物osthin中可能的黃酮類化合物有232種，表3列出了得分在前10的黃酮類化合物數(shù)據(jù)信息，桂花提取物osthin 中 miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J黃酮類化合物得分較高。

3 結(jié)論

分光光度法測(cè)得桂花提取物中黃酮類化合物的濃度為3.58 mg/mL。LC-MS的檢驗(yàn)結(jié)果表明桂花提取物中有 miconioside B、egonol gentiobioside、camellianin A等黃酮類化合物的存在，桂花提取物osthin中有miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J等黃酮類化合物的存在。本研究通過(guò)對(duì)桂花提取物中黃酮類化合物進(jìn)行成分鑒定，為其以后在桂花資源的開(kāi)發(fā)利用、桂花提取物中黃酮類化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和含量測(cè)定等方面的研究提供理論依據(jù)。