高效液相色譜法測(cè)定紙質(zhì)食品接觸材料中雙酚A和雙酚S的含量

楊永超，杜宇，于艷軍，韓偉，李寧濤，熊中強(qiáng)，何成，王利兵

（天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300308）

雙酚A（bisphenol A，BPA）是聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂以及阻燃劑生產(chǎn)過程中經(jīng)常用到的化學(xué)物質(zhì)。近年來，由于BPA的廣泛生產(chǎn)以及在食品接觸材料（food contact materials，F(xiàn)CMs）和食品容器中的大量應(yīng)用，引起了人們極大關(guān)注。試驗(yàn)證明，食品接觸材料中的BPA會(huì)遷移到食物中，遷移速度與食物的溫度、加熱時(shí)間及其理化特性相關(guān)[1-3]。BPA具有雌激素的特性，由于其結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)雌二醇相似，故又稱雌激素或內(nèi)分泌干擾物[4]，接觸BPA會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如生殖和生育能力方面疾病、肥胖和2型糖尿病等[5-7]。

雙酚 S即 4，4-二羥基二苯砜（bisphenol S，BPS），是BPA的等價(jià)物質(zhì)。作為BPA的代用品，BPS通常用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯、酚醛樹脂等物質(zhì)，同時(shí)也用于生產(chǎn)醫(yī)用高分子材料、彩色攝影材料，也可作為固色劑、皮革鞣劑、染料的中間體以及阻燃劑等被廣泛用于食品接觸材料中[8-10]。研究表明，BPS同樣具有生物毒性，是一種內(nèi)分泌干擾素（環(huán)境荷爾蒙），過量攝入會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物的內(nèi)分泌、代謝和神經(jīng)系統(tǒng)異常，可對(duì)人和動(dòng)物生殖系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，還可致癌、致畸和致突變[11-12]。

人類接觸BPA的主要途徑是食用含有BPA的包裝材料包裝的食品，通過皮膚或呼吸方式接觸富含BPA的物質(zhì)[4，13-14]。BPS有很強(qiáng)的皮膚滲透性和吸收率[12]，皮膚接觸后更容易進(jìn)入人體。因此，各國紛紛立法對(duì)食品接觸材料中這2種物質(zhì)遷移量進(jìn)行了限制。根據(jù)歐盟第10/2011號(hào)法規(guī)[15]，BPA對(duì)食品的特定遷移限制（specific migration limit，SML）為 0.6 mg/kg，BPS為0.05 mg/kg。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4806.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用塑料樹脂》[16]規(guī)定了雙酚S特定遷移限量為0.05 mg/kg，雙酚A特定遷移限量為0.6 mg/kg。但這些法規(guī)都是針對(duì)塑料材質(zhì)，未對(duì)紙質(zhì)食品接觸材料進(jìn)行限制。

我國針對(duì)紙質(zhì)食品接觸材料的標(biāo)準(zhǔn)GB 4806.8—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用紙和紙板材料及制品》[17]中未對(duì)BPA和BPS的含量以及遷移量做出具體規(guī)定。然而，據(jù)報(bào)道在歐洲的紙質(zhì)食品包裝材料中發(fā)現(xiàn)了BPA，在回收用于造紙的纖維樣品中也發(fā)現(xiàn)了BPS[18]，證明風(fēng)險(xiǎn)確實(shí)存在。

目前，對(duì)BPA和BPS的檢測(cè)，基質(zhì)多集中在水[19-20]、熱敏紙[11]、紡織品[21]、食品[22-23]以及食品包裝材料[24-25]，但是對(duì)于紙質(zhì)食品接觸材料中的BPA和BPS的檢測(cè)則鮮有報(bào)道。因此，開發(fā)同時(shí)檢測(cè)紙質(zhì)食品接觸材料中BPA和BPS的方法具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，本文以高效液相色譜-二極管陣列（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）為檢測(cè)儀器，建立了同時(shí)測(cè)定紙質(zhì)食品接觸材料中BPA和BPS的方法，為后期市場(chǎng)的監(jiān)管提供技術(shù)支持和保障。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Ultimate 3000SD高效液相色譜儀[配置二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）]：美國 Thermal公司；KQ-800KDE高功率數(shù)控超聲清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司。

雙酚A 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[4，4′-二羥基二苯丙烷（bisphenol A，BPA）]（純度≥99.0%）、雙酚S標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[4，4′-二羥基二苯砜（bisphenol S，BPS）]（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrensorfer公司；甲醇（色譜純）：德國merk公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-CN（C18）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速為0.8 mL/min。柱溫：室溫 25℃；檢測(cè)波長：BPA為280 nm，BPS為259 nm；進(jìn)樣體積5.0 μL。流動(dòng)相為甲醇/水（體積比 1∶1）等度洗脫。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

準(zhǔn)確稱取BPA和BPS各50 mg（精確至0.1 mg）分別置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別移取兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL至50 mL容量瓶，定容，得濃度為100 mg/L的BPA和BPS的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 樣品處理

將紙質(zhì)食品包裝材料裁剪成5 mm×5 mm的小片，混合均勻。精確稱取0.100 0 g樣品置于50 mL的錐形瓶中，加入10 mL甲醇，在50℃恒溫振蕩水浴中提取50 min后取出，氮吹濃縮至5 mL以下，待溶液冷卻至室溫（25℃）后定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液備用。

樣品處理方法參照文獻(xiàn)[26]，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。因?yàn)樗芰现破泛牟闹锌赡艽嬖贐PA和BPS，為避免干擾，樣品處理過程中均用玻璃制品。

1.2.4 陽性樣品制備

將陰性樣品糖炒栗子包裝袋裁剪成5 mm×5 mm的小片，混合均勻，精確稱取0.100 0 g于50 mL的錐形瓶中，加入定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，之后加入適量甲醇，潤濕全部樣品，最后自然揮發(fā)至干得陽性樣品，用于添加回收試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的確定

在190 nm～700 nm范圍內(nèi)，測(cè)定雙酚A（BPA）和雙酚S（BPS）標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外-可見吸收光譜，結(jié)果表明，BPA的兩個(gè)吸收峰波長為228 nm和280 nm，BPS的最大吸收峰波長為259nm。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11，22-23]及為了避免在200 nm左右的溶劑和雜質(zhì)峰的干擾，方法選擇BPA的檢測(cè)波長為280 nm，BPS為259 nm。

2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了Acclaim 120-C18、InertSustain C18和ZORBAX Eclipse XDB-CN（規(guī)格均為 250 mm×4.6 mm，5 μm）反相柱分離效果，結(jié)果見圖1。

圖1 不同色譜柱對(duì)分離效果的影響（280 nm）Fig.1 Effects of different chromatographic columns on separation efficiency（280 nm）

結(jié)果表明Acclaim 120-C18和InertSustain C18柱BPS 出峰較早，BPA 出峰過晚[圖 1（d）和圖 1（c）]。梯度洗脫可縮短洗脫時(shí)間，但容易造成基線不穩(wěn)，同時(shí)消耗更多的有機(jī)相[圖 1（b）]。ZORBAX Eclipse XDB-CN柱則可通過調(diào)整流動(dòng)相等度洗脫，10 min內(nèi)可完成洗脫，且峰形尖銳對(duì)稱，因此，選擇ZORBAX Eclipse XDB-CN柱進(jìn)行等度洗脫。

2.3 流動(dòng)相、流速及進(jìn)樣體積的選擇

試驗(yàn)考察了乙腈/水、甲醇/水作流動(dòng)相對(duì)BPA和BPS分離效果的影響，結(jié)果表明，使用乙腈/水時(shí)，BPS的峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)使用甲醇/水時(shí)，BPA、BPS完全分離，峰形尖銳，對(duì)稱性好，因此，選擇甲醇/水作為流動(dòng)相。

兩種物質(zhì)在甲醇/水等度洗脫過程中，可實(shí)現(xiàn)完全分離。等度洗脫過程中，最終確定流動(dòng)相比例為甲醇/水體積比1∶1，該條件下，BPA和BPS分離度好，BPS出峰時(shí)間大于5 min，可避免一些雜質(zhì)峰的影響，且整體洗脫時(shí)間可控制在10 min之內(nèi)。

流動(dòng)相流速對(duì)分離效果的影響見圖2。

圖2 流動(dòng)相和流速對(duì)分離效果的影響（280 nm）Fig.2 Influence of flow phase and velocity on separation effect（280 nm）

由圖 2（a）～圖 2（c）可知，流速為 0.5 mL/min 時(shí)，洗脫時(shí)間大于12 min，且峰形展寬；流速為1.0 mL/min時(shí)，BPS出峰時(shí)間小于5 min，可能會(huì)有基質(zhì)中的雜質(zhì)峰干擾。綜合考慮，試驗(yàn)最終選定流速為0.8 mL/min。

進(jìn)樣量為 10 μL 時(shí)[圖 2（d）]，峰形前沿，進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)[圖 2（b）]，色譜峰恢復(fù)正常，說明這種情況可能是由色譜柱過載造成的，因此，試驗(yàn)最終選定進(jìn)樣量為 5 μL。

2.4 提取劑的選擇

試驗(yàn)考察了甲醇、正己烷、乙腈和水的提取效率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溶劑對(duì)于BPA和BPS的提取效率的影響Fig.3 The efficiencies of different solvents for BPA and BPS

結(jié)果表明，對(duì)于BPA和BPS的提取，甲醇的提取效率＞98%，其它溶劑的提取效率均＜80%，因此，方法最終選擇甲醇為提取劑。

2.5 提取溫度和時(shí)間的確定

甲醇作為萃取劑，研究最佳的提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig.4 The effect of extraction time and temperature on extraction efficiencies

從圖4（a）中可以看出，隨著溫度的增加，BPA和BPS的提取效率增加，50℃時(shí)達(dá)到最高，60℃與50℃時(shí)基本持平，從能源節(jié)省和減少甲醇揮發(fā)方面考慮，方法選擇的提取溫度為50℃。

如圖4（b）所示，提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取接近完全，40 min～60 min變化不明顯，考慮到分析物盡可能提取完全和節(jié)省資源，方法最終選擇提取時(shí)間為40 min。

2.6 線性范圍和檢測(cè)限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）

精密量取1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以甲醇稀釋，得到 BPA 和 BPS 濃度為 1、5、10、25、50 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。上機(jī)測(cè)試，記錄BPA和BPS的峰面積，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)試3次，取平均值。以濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行線性回歸。得到的回歸方程如表1所示，結(jié)果顯示，在1 mg/L～50 mg/L范圍內(nèi)，BPA和BPS線性良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.999 8。

表1 BPS和BPS的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限、定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，the limit of detection and quantification（LOD and LOQ）for BPA and BPS

采用逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液方法進(jìn)樣，信噪比（S/N）為3時(shí)的樣品濃度即為檢測(cè)限濃度（LOD）；S/N為10的樣品的濃度即為定量限濃度（LOQ）。如表1所示，BPA、BPS的 LOD和 LOQ分別為 0.10、0.02 mg/L和0.50、0.10 mg/L。

2.7 回收率和精密度試驗(yàn)

按1.2.4方法制備低、中、高3個(gè)濃度水平陽性樣品，測(cè)試添加回收率，每個(gè)濃度點(diǎn)平行6份，結(jié)果見表2。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[27]對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，試驗(yàn)三水平添加回收率在85.2%～103.0%之間，表明加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果良好。相應(yīng)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.26%～4.90%之間，證明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 BPA和BPS低、中、高3濃度水平添加回收試驗(yàn)（n=6）Table 2 Recovery results of BPA and BPS at 3 levels with low，medium and high concentrations（n=6）

2.8 樣品檢測(cè)

取市場(chǎng)上30個(gè)紙質(zhì)食品接觸材料樣品，按1.2.3所述方法制備樣品上機(jī)測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示，2個(gè)樣品檢出BPA，編號(hào)1#和2#，結(jié)果見圖5。

圖5 市場(chǎng)實(shí)際樣品檢測(cè)圖譜（280 nm）Fig.5 The spectra of actual samples in market（280 nm）

由圖5可知，1#樣品檢出少量BPA，同時(shí)樣品5 min以前出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰。該方法BPA的出峰時(shí)間大于5 min，可有效避免大部分雜質(zhì)干擾。2#樣品除了檢出較高濃度的BPA[圖5（b）峰1]，在12 min左右出現(xiàn)峰2，查看其后臺(tái)紫外吸收?qǐng)D譜，基本與BPA紫外圖譜一致，推測(cè)為BPA的衍生物或同系物，后續(xù)工作將對(duì)該物質(zhì)展開研究。

3 結(jié)論

本文建立了紙質(zhì)食品包裝材料中BPA和BPS含量測(cè)定的高效液相色譜法。方法中BPA和BPS的最低檢出限可達(dá)0.10 mg/L和0.02 mg/L，加標(biāo)回收率在85.2%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。該方法具有前處理簡單、穩(wěn)定性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于市場(chǎng)上紙質(zhì)食品接觸材料制品中BPA和BPS的測(cè)定，為食品包裝材料的安全監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持和保障。