巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的生防效果及成分鑒定

丁從文，韋羅晴，馬忠璇，周尚澤

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

研究表明，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，BM）對一些食品病害如香蕉大灰斑病、小麥紋枯病、辣椒疫霉病、花生黃曲霉病及生姜青枯病等均有良好的生防效果[1-5]。也有研究報(bào)道BM z12及BM B1301粗提液對水稻紋枯病菌（Corticium sasakii）有抑制效果[6-7]，吉玉玉等[8]報(bào)道BM L2粗提物對番茄青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）有抑制作用，趙妗頤等[9]報(bào)道BM L2粗提物對魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）有抗菌活性。然而，關(guān)于BM粗提物對由炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）引起的芒果炭疽病的防治測試及BM粗提物中活性成分的分離鑒定，文獻(xiàn)中少見報(bào)道。

前期研究已表明，BM LB01發(fā)酵濾液抑制了采后芒果CG菌絲生長和孢子萌發(fā)，抑制了芒果炭疽病的病斑擴(kuò)展及芽管伸長[10]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）、石油醚（petroleun ether，PE）和二氯甲烷（dichloromethane，DCM）等有機(jī)溶劑對BM LB01發(fā)酵濾液中活性成分進(jìn)行萃取，研究其粗提物對采后貯藏期芒果炭疽病菌的抑菌效果，并對防病效果最佳的粗提物進(jìn)行活性成分分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，本期研究將為防治采后芒果炭疽病的新藥合成提供微生物源先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株BM LB01：分離于百色市靖西縣巖溶區(qū)芒果園果樹根基土壤，保存于百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院天然有機(jī)化學(xué)研究室芽孢桿菌菌株儲藏柜；病原菌CG：百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院提供；七成熟“臺農(nóng)”1號芒果：百色市靖西縣巖溶區(qū)芒果園；EA、PE、二甲基亞砜、DCM、施?？耍ǚ治黾儯何鱽喕瘜W(xué)科技（山東）有限公司；柱層析硅膠粉（100目～200目）、薄層層析硅膠板（F254）：煙臺維啟化工產(chǎn)品有限公司；大孔吸附樹脂（D101）：天津市津達(dá)正源有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MFa-b微孔膜過濾器：杭州惠合機(jī)械設(shè)備有限公司；XPR微量電子天平：梅特勒-托利多國際有限公司；GGC-X小型試管翻轉(zhuǎn)振蕩萃取器：北京國環(huán)高科自動化技術(shù)研究院；SE-1000小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京儀信網(wǎng)通科技有限公司；LGZE-250型生化培養(yǎng)箱：杭州勒豐科技有限公司；EasYDish圓形細(xì)胞培養(yǎng)皿：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；M2200-12道移液槍：杭州中旺科技有限公司；EFT-60/90臺式核磁共振波譜儀：QUANTUM量子科學(xué)儀器貿(mào)易（北京）有限公司；HT-JZ-1接種器：濟(jì)南騰昊科學(xué)儀器有限公司；DSX-280KB24高壓滅菌器、ZX-1800超凈工作臺：凱越機(jī)械有限公司；RMP-SAC生物層析柱：江陰市新輝層析設(shè)備有限公司；Nexera MP制備型高效液相色譜儀：廣州領(lǐng)托貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的制備

參考文獻(xiàn)[10]的方法制備900 mL BM LB01無菌發(fā)酵濾液，于此發(fā)酵濾液中加入900 mL EA和200 mL H2O，劇烈搖動1 h，浸泡24 h，靜置分層后取上層EA相。下層水相再次用等體積的EA浸泡相同時(shí)間，共萃取3次。將3次得到的EA相合并，用無水Na2SO4干燥后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，收集EA相浸膏。

采用同樣的操作方法，制備PE和DCM相浸膏。

1.3.2 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的防治效果測定

1.3.2.1 藥液配制

采用電子天平準(zhǔn)確稱量EA相浸膏1、2、4 mg溶解于熔融（45℃）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基或者二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，配制 20、40、80 μg/mL 3 個系列濃度（藥量500 mL），貼上標(biāo)簽，用于測定三類溶劑粗提物的體外和體內(nèi)抗菌活性。稱取4 mg施?？巳苡贒MSO中配制80 μg/mL藥液，供試體積用量為500 mL。

采用同樣的配制方法，配制PE和DCM相浸膏20、40、80 μg/mL 3 個系列濃度（藥量 500 mL）。

1.3.2.2 培養(yǎng)基的配制及病原菌CG分生孢子懸浮液的制備

參照文獻(xiàn)[11-13]的方法，進(jìn)行PDA、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制及病原菌CG分生孢子懸浮液的制備，病原菌CG分生孢子懸浮液培養(yǎng)時(shí)間為4 d，并將其濃度調(diào)節(jié)為1.0×106/mL。

1.3.2.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的體外抗菌活性測定

將EA、PE和DCM萃取相浸膏添加到熔融的PDA（45℃）培養(yǎng)基中，得到最終質(zhì)量濃度分別為0、20、40、80 μg/mL的萃取相浸膏。在PDA板中心接種直徑為6 mm的菌餅，黑暗中28℃恒溫培養(yǎng)。直至對照組病原菌CG菌絲貼近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，用游標(biāo)卡尺計(jì)量菌落生長直徑。每個菌落用十字交叉法垂直測量各一次，取其平均值。根據(jù)計(jì)量的菌絲生長直徑，計(jì)算BM LB01粗提物對病原菌CG菌絲生長抑制率，并比較不同溶劑粗提物對CG菌絲生長的抑制活性，依據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法，統(tǒng)計(jì)BM LB01粗提物在1 d～6 d內(nèi)對病原菌CG的菌絲生長抑制率。抑制率按如下公式計(jì)算。

1.3.2.4 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的體內(nèi)抗菌活性測定

以七成熟的“臺農(nóng)”1號芒果為試驗(yàn)材料，用無菌水對芒果進(jìn)行沖洗，用NaClO消毒，在空氣中風(fēng)干后于芒果果實(shí)中心位置打孔（孔寬4.5 mm，孔深1.5 mm），用于接種病原菌CG和各類藥劑，進(jìn)行體內(nèi)抗菌活性試驗(yàn)。

試驗(yàn)共分為6個小組，10次重復(fù)。

（1）陰性對照組（編號為T1）：未給藥，也未接種病原菌 CG；（2）陽性對照組（編號為 T2）：僅接種 CG；（3）處理組（編號為 T3）：200 μL 80 μg/mL 施?？?CG；（4）處理組（編號為T4）：200 μL BM LB01發(fā)酵濾液+CG；（5）處理組（編號為 T5）：200 μL 80 μg/mL EA 粗提物藥液+CG；（6）處理組（編號為 T6）：200 μL 80 μg/mLPE粗提物藥液+CG。

除T1外的所有處理中，芒果果實(shí)傷口接種的病原菌CG分生孢子懸浮液的體積和濃度均為100 μL、1.0×106/mL，T3～T6組接種各類藥液1.5 h后，再接種病原菌CG。參考文獻(xiàn)[15]的計(jì)算方法，于第7天統(tǒng)計(jì)供試組芒果病斑面積（lesion area，LA）及藥劑生防效果（biocontrol efficacy，BE）。

1.3.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物化學(xué)成分的分離純化

將EA相浸膏（5 g）和D101大孔樹脂（5 g）混合于燒瓶中，再注入250 mL PE，室溫（20℃～25℃）下電磁攪拌5 min，用砂芯漏斗抽濾，用干法將樣品裝上大孔樹脂柱初步分離，不同體積比（5∶1、1∶1、1∶5）洗脫劑PEEA對樣品進(jìn)行減壓梯度洗脫[16]，共收集到F1～F4 4個組分，組分F3（90 mg）用100目～200目硅膠柱分離，洗脫劑 DCM-PE（體積比為 1∶5、1∶1、5∶1）進(jìn)行梯度洗脫，共收集到F5～F8 4個組分。用薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）檢測，用反相制備型高效液相色譜法進(jìn)行精細(xì)分離純化[17]。將 F2（75 mg）和 F8（95 mg）組分用反相制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化，洗脫劑 CH3CN-H2O（體積比 1∶4）洗脫，最終獲得單一活性成分 a（28 mg）、b（30 mg）、c（32 mg）。

1.3.4 巨大芽孢桿菌LB01粗提物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

將單一活性成分a、b、c溶于DMSO-d6（碳譜測定無需氘代溶劑），形成溶液后加入核磁管進(jìn)行氫譜（1hydrogen nuclear magnetic resonance，1H-NMR）和碳譜（13carbon nuclear magnetic resonance，13C-NMR）測定，獲取的數(shù)據(jù)與原始文獻(xiàn)比對鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010對數(shù)據(jù)作圖，通過SPSS軟件，進(jìn)行結(jié)果差異性分析，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病菌生長的體外抑制

采用乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）和二氯甲烷（DCM）為萃取劑，從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）LB01 發(fā)酵濾液中萃取的 0（對照）、20、40、80 μg/mL等不同濃度的粗提物對PDA平板上炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）生長的抑制作用情況，如圖1所示。

圖1 不同濃度粗提物對PDA板上炭疽病菌的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of crude extracts with different concentrations against Colletotrichum gloeosporioides on PDA board

由圖1可知，EA、PE和DCM粗提物對PDA平板上接種的炭疽病菌的抑制活性順序?yàn)镋A相浸膏＞PE相浸膏＞DCM相浸膏。

表1～表3為不同濃度的EA、PE和DCM粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率。

表1 不同濃度的EA粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 1 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by EA on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表2 不同濃度的PE粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 2 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by PE on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表3 不同濃度的DCM粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 3 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by DCM on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表1～表3顯示，EA和PE粗提物抑制病原菌生長的效果優(yōu)于DCM。EA和PE粗提物（80 μg/mL）在培養(yǎng)2 d后對病原菌生長的抑制率最高，分別為（76.2±5.2）%和（75.3±6.5）%。第2天后，不同溶劑粗提物對病原菌的生長抑制效果隨處理時(shí)間的延長而降低。而不同溶劑粗提物的抗菌活性隨粗提物濃度的增加而增加，反之亦然。由于DCM粗提物的抗菌活性較低，因此選擇EA和PE粗提物進(jìn)行芒果果實(shí)體內(nèi)防治試驗(yàn)測定。

2.2 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的體內(nèi)防治效果

為研究巨大芽孢桿菌LB01 EA和PE粗提物對采后芒果炭疽病的體內(nèi)防治效果，本試驗(yàn)于第7天觀察了供試組（T1～T6）芒果的發(fā)病情況，測定了它們的病斑面積，并統(tǒng)計(jì)了各類藥劑的生防效果。其試驗(yàn)結(jié)果如圖2及表4所示。

圖2 芒果貯藏至第7天后的炭疽病發(fā)病情況Fig.2 Symptoms of postharvest mango anthracnose after 7 days storage

表4 不同藥劑處理對采后芒果炭疽病病斑面積及生防效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Statistical results of lesion area and biocontrol efficacy of postharvest mango anthracnose treated with different fungicides

由圖2可以得出，陽性對照組（T2）接種芒果炭疽病菌7 d后出現(xiàn)明顯的炭疽病病害癥狀，傷口擴(kuò)大并覆蓋了整個損傷口區(qū)域。施保克處理組（T3）和EA粗提物處理組（T5）的芒果發(fā)病程度相似，并且比較輕微。T3和T5對芒果采后炭疽病的防治效果明顯優(yōu)于巨大芽孢桿菌LB01發(fā)酵濾液（T4）及PE粗提物處理組（T6）。陰性對照組（T1）沒有接種芒果炭疽病菌，也沒有給藥，但貯藏至第7天后，T1與T5～T6類似，也出現(xiàn)病斑，可能是潛伏于采前芒果中的炭疽病菌所致。

由表4統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，采用化學(xué)殺菌劑施保克（T3）和EA粗提物（T5）施藥1.5 h后，于芒果果實(shí)損傷口上接種炭疽病菌孢子懸浮液（1.0×106/mL），培養(yǎng)7 d后芒果炭疽病受到強(qiáng)烈抑制。T3和T5組的芒果病害表現(xiàn)狀態(tài)與T1（陰性對照）相似。巨大芽孢桿菌LB01發(fā)酵濾液和PE粗提物對芒果炭疽病的防治效果均低于EA粗提物。EA粗提物（T5）的病斑面積（LA）與陽性對照組（T2）相比較，顯著降低（p＜0.05），并且 EA 粗提物（T5）對芒果炭疽病的防治效果高達(dá)（89.55±1.12）%，比T4和T6高10%以上。

2.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定

將體外和體內(nèi)防病效果均最佳的EA粗提物浸膏通過大孔樹脂、硅膠和反相制備型液相色譜分離純化后獲得3個單體化合物a、b、c，其熔點(diǎn)、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)如下。

化合物a：無色針狀晶體，熔點(diǎn)201℃～203℃；1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ:3.29（2H，s，H-2），6.71（2H，d，J=7.6 Hz，H-5，7），7.15（2 H，d，J=7.6 Hz，H-4，8）；13CNMR（150 MHz，CH3CN）δ:39.8（C-2），119.1（C-5，7），126.0（C-3），132.1（C-4，8），160.3（C-6），181.3（C-1）。以上熔點(diǎn)及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道的4-羥基苯乙酸的數(shù)據(jù)相符。

化合物b：無色針狀晶體，熔點(diǎn)187℃～189℃；1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ:5.64 （2H，s，-NH2），6.83（2H，d，J=10.0 Hz，H-3，7），7.78 （2H，d，J=10.0 Hz，H-4，6）；13C-NMR（150 MHz，CH3CN）δ:114.9（C-2），117.2（C-3，7），134.2（C-4，6），156.1（C-5），179.5（C-1）。以上熔點(diǎn)及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道的4-氨基苯甲酸的數(shù)據(jù)相符。

化合物c：淺黃色晶體，熔點(diǎn)174℃～176℃；1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ:3.92（3H，s，H-10），6.62（1H，d，J=16.1 Hz，H-9），6.96（1H，d，J=9.2 Hz，H-5），7.07（1H，dd，J=9.2，2.4 Hz，H-3），7.31（1H，d，J=2.4 Hz，H-2），7.82（1H，d，J=16.1Hz，H-8）。13C-NMR（150 MHz，CH3CN）δ:53.7（C-10），111.2（C-3），116.4（C-5），116.9（C-8），123.3（C-6），126.1（C-9），145.3（C-4），149.1（C-7），150.2（C-2），178.0（C-1）。以上熔點(diǎn)及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道的3-甲氧基-4-羥基肉桂酸的數(shù)據(jù)相符。

基于以上數(shù)據(jù)可以推斷粗提物中化學(xué)成分a、b、c的結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 EA粗提物中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structural formula of compounds from crude extract of EA

3 結(jié)論

本試驗(yàn)先用乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）和二氯甲烷（DCM）3種不同極性有機(jī)溶劑作為萃取劑制備了3類巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，BM）LB01粗提物。PDA平板離體試驗(yàn)法確認(rèn)了0（對照）、20、40、80 μg/mL EA和PE粗提物抗菌活性明顯強(qiáng)于DCM粗提物，芒果活體試驗(yàn)中，80 μg/mL EA粗提物對采后芒果炭疽病的活體防治效果類似于化學(xué)殺菌劑施?？?，且顯著優(yōu)于PE粗提物。最后采用大孔樹脂、硅膠柱及制備型液相色譜等方法對防病效果最佳的EA粗提物化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，通過氫譜和碳譜數(shù)據(jù)測定，并與原始數(shù)據(jù)比照進(jìn)行化學(xué)成分鑒定，共獲得3個化合物 a（4-羥基苯乙酸）、b（4-氨基苯甲酸）、c（3-甲氧基-4-羥基肉桂酸）。