茯苓多糖對乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷的輔助保護(hù)作用

潘世杰，丁麗婷，胡婕倫，鐘亞東，黃鉆元，趙明姣，方芳，聶少平，鐘虹光，堯梅香，謝明勇*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實驗室（南昌），江西 南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西 九江 330000）

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在中國，胃病發(fā)生率高達(dá)85%，其中胃癌居我國城市男女高發(fā)癌癥的前5位，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。

胃病發(fā)生和發(fā)展的一個重要表現(xiàn)就是胃黏膜損傷，其主要誘因包括酸堿平衡失調(diào)、胃幽門螺旋桿菌侵襲和胃腸黏膜的化學(xué)性損傷[2]，可歸結(jié)為胃黏膜的防護(hù)因子及攻擊因子失衡，造成胃黏膜內(nèi)的防護(hù)因子弱于攻擊因子，進(jìn)而產(chǎn)生胃黏膜損傷[3]。到目前為止，研究人員已開發(fā)出了胃酸中和藥、H2受體拮抗劑、H+泵抑制劑等用于臨床，使胃黏膜損傷性疾病的治療取得了一定進(jìn)展。但是，抗酸藥仍存在許多亟待解決的問題，如治療時間長、潰瘍愈合遲緩、復(fù)發(fā)率高、副作用多等[4]。因此，人們一直在尋找其它替代藥物。

多糖是廣泛存在于自然界的生物大分子，與蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)共同構(gòu)成了最基本的生命物質(zhì)[5]，與人類生活密切相關(guān)，對維持生命活動起著至關(guān)重要的作用。除此之外，多糖還被證實具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)[6-9]、抗氧化[10-13]、抗腫瘤[13-14]、胃腸道保護(hù)[15-17]、降血糖[18-20]、抗炎[21-22]等。如果能夠通過多糖來輔助治療胃腸道疾病，不僅可對醫(yī)藥和食品行業(yè)發(fā)展起到積極作用，也將對人類健康作出有利貢獻(xiàn)。

茯苓是中醫(yī)里廣泛使用的傳統(tǒng)“藥食同源”食材，具有滲濕利水、益脾和胃、寧心安神的功效[23]，許多經(jīng)典養(yǎng)胃健脾方劑中都有茯苓的身影。多糖作為茯苓的主要活性成分，已被證實具有抗腫瘤[24]和提高免疫力[25-26]等作用，但其在胃保護(hù)方面的作用鮮有報道。本文通過建立乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷模型[27]，探究茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）對胃黏膜損傷的輔助保護(hù)作用，并為PCP保護(hù)胃黏膜損傷的機(jī)制研究提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓原料：江中食療科技有限公司。西咪替丁：美國Sigma公司；小鼠白細(xì)胞介素-10（interlrukin-10，IL-10）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胃蛋白酶活性酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER TOLEDO XS105電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器公司；JJ-12J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司；KD-P組織攤片機(jī)：金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；RM2016病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；3K15高速臺式離心機(jī)：德國Sigma公司；3001全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（多功能酶標(biāo)儀）：美國Thermo公司；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；LAQUAtwin-Ph-33微量PH計：日本HORIBA公司；KZ-II組織破碎儀：武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

清潔級5周齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量32 g～38 g，許可證號：SCXK（京）2016-0011，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗過程中所有動物實驗嚴(yán)格遵守南昌大學(xué)動物管理條例，倫理委員會鑒定許可。實驗墊料、飼料經(jīng)過輻照殺菌處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理。

1.4 方法

1.4.1 茯苓多糖的提取與制備

茯苓粉用5倍體積95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良后的熱水浸提結(jié)合酶輔助醇沉法提取PCP[28]。將提取液旋蒸濃縮至原體積1/5，采用Sevage法脫蛋白，之后依次用自來水流水透析2 d，蒸餾水透析1 d，再旋蒸濃縮，倒平板凍干即得茯苓多糖。

1.4.2 乙醇致胃黏膜損傷動物模型的建立

將60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、西咪替丁組和PCP低、中、高劑量組，每組10只。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，開始正式實驗后，每天稱重并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量（0.1 mL/10 g）。PCP每天灌胃劑量：低劑量組0.05 g/kg bw、中劑量組0.1 g/kg bw、高劑量組0.2 g/kg bw，正常組、模型組、西咪替丁組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水。持續(xù)灌胃12 d。第13天，西咪替丁組按1 mg/10 g bw灌胃西咪替丁，其它組保持不變，持續(xù)3 d。第16天造模前，各組小鼠均嚴(yán)格禁食不禁水12 h，期間亦禁止給予受試物。正式造模當(dāng)天，各組均繼續(xù)灌胃對應(yīng)受試物，1 h后，正常組按0.1 mL/10 g給予生理鹽水，其余組均按0.1 mL/10 g給予70%乙醇，70 min后處死。

1.4.3 臟器指數(shù)的測定

正式造模當(dāng)天稱量并記錄體重后，處死，取臟器（肝臟、腎臟、脾臟、胸腺）并用生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重記錄，用于計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)/（mg/g）=器官質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）

1.4.4 胃液pH值的測定

小鼠處死后，剪開腹部取出胃，沿胃大彎剪開，小心取出內(nèi)容物后，在（25±2）℃條件下，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，用微量pH計測出小鼠胃液pH值。

1.4.5 直觀胃黏膜損傷情況觀察及胃黏膜損傷指數(shù)的測定

小鼠處死后，剪開腹部取出胃，沿胃大彎剪開，洗凈殘留內(nèi)容物后展開固定，拍照記錄。肉眼觀察并記錄褶皺和出血點個數(shù)，用游標(biāo)卡尺測量損傷條帶的長度和寬度。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1[29]。

表1 胃黏膜損傷指數(shù)評分Table 1 Gastric mucosal injury index score

胃黏膜損傷指數(shù)=出血點分?jǐn)?shù)+糜爛長度分?jǐn)?shù)+糜爛寬度分?jǐn)?shù)×2

1.4.6 胃組織病理觀察

選取每只小鼠胃黏膜損傷最嚴(yán)重部位，切下約10 mm×2 mm的組織，固定于4%福爾馬林溶液中，常規(guī)梯度脫水、包埋、切片、烤片，HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.7 胃組織勻漿液制備

將胃沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物并展開胃黏膜。將胃組織與磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）按體積比 1∶9 混合，加入 4 mm 研磨珠，用組織破碎儀進(jìn)行破碎，制得10%胃組織勻漿。將勻漿液以3 500 r/min在4℃下離心10 min，取上清液，得組織勻漿上清液，以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.8 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性測定

參照試劑盒說明書，測定胃組織勻漿上清液中的IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graph-Pad Prism 8軟件作圖；采用單因素ANOVA分析和Tukey′s多因素t檢驗進(jìn)行顯著性分析。p＜0.05時，表示組間具有顯著差異；p＜0.01時，表示具有極顯著差異；0.05＜p＜0.1時，表示與正常組相比傾向于具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 伏苓多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響

各組小鼠臟器指數(shù)見表2。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)Table 2 Organ index of mice in each group

如表2所示，各實驗組之間肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均無顯著性差異，但模型組肝臟指數(shù)與正常組相比傾向于具有顯著差異。說明乙醇致胃黏膜損傷模型對小鼠的其它臟器無明顯損傷，現(xiàn)有實驗條件下茯苓多糖及西咪替丁對小鼠無顯著毒副作用。

2.2 胃黏膜表觀

各組胃黏膜直觀圖見圖1。

圖1 各組胃黏膜直觀圖Fig.1 The direct view of gastric mucosa in each group

由圖1可知，正常組小鼠胃黏膜完整，形態(tài)和色澤正常，未見出血、潰瘍、糜爛等異常情況；模型組小鼠胃黏膜有明顯的出血、潰瘍和糜爛，可見粗大的出血條帶及大量的出血點，表明乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷模型造模成功；西咪替丁組小鼠胃黏膜有少量出血點，未見潰瘍、糜爛等情況，說明西咪替丁能有效防止胃黏膜損傷；PCP低、中、高劑量組均有少量出血點，未見潰瘍、糜爛等情況，說明PCP能有效防止胃黏膜損傷。

2.3 伏苓多糖對胃液pH值的影響及損傷評價

胃液pH值及胃黏膜損傷評價見圖2。

圖2 胃液pH值及胃黏膜損傷評價Fig.2 PH of gastric juice and evaluation chart of gastric mucosal injury in each group

由圖2A可知，模型組胃液pH值極顯著高于正常組（p＜0.01），西咪替丁是胃酸抑制劑，故西咪替丁組胃液pH值與正常組和模型組差異極顯著。PCP低劑量組與模型組相比未能降低胃液pH值，而PCP中、PCP高劑量組相比模型組pH值均顯著降低，且數(shù)值與正常組無顯著差異。

由圖2B可知，模型組損傷評分極顯著高于其它組，說明乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷造模成功。其余各給藥組相比模型組損傷評分均有極顯著下降，其中PCP高劑量組評分最低，且與正常組無顯著差異，之后依次為西咪替丁組、PCP中劑量組和PCP低劑量組。

2.4 胃組織病理學(xué)觀察

各組胃組織病理學(xué)觀察圖見圖3。

圖3 各組胃組織病理學(xué)觀察圖（×200 μm）Fig.3 Histopathological observation of stomach in each group（×200 μm）

如圖3所示，正常組小鼠胃組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、水腫及充血現(xiàn)象。與正常組相比，模型組小鼠胃組織腺體結(jié)構(gòu)紊亂，胃黏膜嚴(yán)重充血，上皮細(xì)胞大量脫落，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，西咪替丁組和PCP低、中、高劑量組胃黏膜損傷狀態(tài)均有明顯改善，胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、胃黏膜充血及腺體結(jié)構(gòu)紊亂情況有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少。由此可知，西咪替丁和PCP低、中、高劑量都對胃黏膜損傷有輔助保護(hù)作用。

2.5 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性測定結(jié)果

胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性見圖4。

圖4 胃組織IL-10、LPS含量及胃蛋白酶活性變化Fig.4 The content of IL-10、LPS and the activity change of pepsin in gastric tissue

由圖4可知，模型組IL-10含量極顯著低于正常組，PCP低劑量組與模型組有顯著差異，其余各給藥組與模型組相比均無明顯差異；模型組LPS含量極顯著高于正常組，各給藥組均較模型組有一定降低，其中西咪替丁組和PCP低、中劑量組與模型組相比有極顯著差異，PCP高劑量組與模型組相比無明顯差異；模型組胃蛋白酶活性與正常組相比有極顯著差異，各給藥組相對模型組均有極顯著改善。

3 結(jié)論

飲酒伴隨著中國傳統(tǒng)文化傳承多年，形成了中國特有的“酒文化”，但酒精會對人體造成傷害。本文通過臟器指數(shù)數(shù)據(jù)可知，短時間乙醇暴露雖未對其它臟器造成不利影響，但肝臟指數(shù)有增大的趨勢，因此在傳承“酒文化”的同時降低酒精對人的傷害成了近年來熱門的研究方向。茯苓作為常見的“藥食同源”食材，有很大的利用前景和發(fā)展空間。本實驗各項結(jié)果表明，茯苓多糖可以恢復(fù)胃正常狀態(tài)下的產(chǎn)酸能力，同時通過降低胃蛋白酶活性以及減少胃組織中脂多糖含量起到對胃黏膜的輔助保護(hù)作用。實驗結(jié)論可為以茯苓多糖為原料的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。值得注意的是，茯苓多糖對胃黏膜損傷具體的保護(hù)機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探討。