二精方顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙雨，褚海清，王結(jié)鑫，王倩，張立明,2,3*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

0 引言

二精方顆粒劑是由枸杞、黃精兩味中藥材配伍通過(guò)現(xiàn)代制劑技術(shù)制成的一種制劑，在古方《圣濟(jì)總錄》中記載二精方以丸劑為劑型，以蜜調(diào)和，主“筑氣益精、補(bǔ)填丹田，活血駐顏，長(zhǎng)生不老”[1]。本研究前期實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠進(jìn)行二精方多糖及黃酮類提取物干預(yù)，其具有降糖降脂、緩解糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀[2-4]，因此，將其開(kāi)發(fā)成具有降糖功效的顆粒劑，且顆粒劑療效迅速，能滿足患者攜帶使用方便、易于貯存的愿望。

目前，關(guān)于二精方顆粒的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)還未見(jiàn)報(bào)道。方中兩味藥材枸杞和黃精均為益陰藥，且所含多糖類成分和黃酮類成分較多，枸杞的現(xiàn)代研究表明其枸杞多糖具有抵抗衰老、保護(hù)神經(jīng)和心血管、抗氧化和預(yù)防糖尿病的作用[5-6]，黃精中的主要活性成分多糖和黃酮類也具有抗氧化、降低血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫力等作用[7]?；谏鲜鲅芯考扒捌诘膶?shí)驗(yàn)證明枸杞、黃精中的多糖及黃酮類成分對(duì)糖尿病具有一定的預(yù)防和治療作用。鑒于此，本研究旨在建立二精方顆粒劑中枸杞和黃精的TLC鑒別法，多糖類及黃酮類成分的高效液相色譜法(HPLC)，以期為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KQ-250E型超聲波器(昆山市超器有限公司)；恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電子計(jì)重秤(廈門(mén)佰倫斯電子科技有限公司)；粉碎機(jī)(屹立工貿(mào)有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；分析天平(梅特勒-托利多)；高效液相色譜儀(Agilent 1260)。

1.2 試藥

枸杞(批號(hào)：070101，產(chǎn)地：寧夏，石家莊市柏林藥材加工廠)；黃精(批號(hào)：070101，產(chǎn)地：四川，石家莊市柏林藥材加工廠)標(biāo)準(zhǔn)品：D-葡萄糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201506)；D-甘露糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140651-201504)；蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707)。

2 方法與結(jié)果[8-9]

2.1 枸杞的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備

取本品1.0 g，研細(xì)，加水70 mL，加熱煮沸15min，放冷，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯30mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至l mL，即得。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備

取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水35 mL，加熱煮沸15min，放冷，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯15mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至l mL，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照液的制備

按處方除枸杞外的藥材制備顆粒，據(jù)2.1.1項(xiàng)下處理，即得。

2.1.4 TLC鑒別

照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3：2：1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果，在枸杞對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品品顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照物干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 枸杞的薄層色譜鑒別

2.2 黃精的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品l.0 g，研細(xì)，加70%乙醇 20 mL，加熱回流1h，抽濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状糽 mL使溶解，即得。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備

取黃精對(duì)照藥材l.0 g，加70%乙醇 20 mL，加熱回流1h，抽濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL 使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状糽 mL使溶解，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液的制備

按處方除黃精外的藥材制備顆粒，據(jù)2.1.1項(xiàng)下處理，即得。

2.2.4 TLC鑒別

照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5：2：0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，在黃精對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品品顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照物干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 黃精薄層色譜圖

2.3 二精方中多糖類成分的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

安捷倫 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8)(A)：乙腈 (B)=84：16 等度洗脫；流速為 1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，柱溫為 30℃，進(jìn)樣量為 10 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取葡萄糖、甘露糖分別置于試管中，分別加入0.3 mol·L-1的NaOH溶液5 mL振蕩溶解，取溶解后的溶液100 μL，加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液50 μL，70℃水浴中反應(yīng)30 min后冷卻至室溫，加0.3mol·L-1的鹽酸100 μL中和，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，針筒式微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為多糖類成分對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取約5 g，加水溶解，加入氯仿-正丁醇(4：1)混合溶液脫蛋白，劇烈振蕩后離心，得上清液，加入95%的乙醇，靜置過(guò)夜后過(guò)濾，所得沉淀依次用 95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干得精制多糖。取精制多糖50 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃ 烘箱中水解8 h，吹干，殘?jiān)蛹状? mL，使溶解，吹干，加水使溶解，即得多糖水解液。在水解液中加 1.2 mL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，1 mL的氫氧化鈉溶液，混勻，置水浴加熱，取出，冷卻至室溫，加鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，針筒式微孔濾膜過(guò)濾，即得。

將制備的供試品與標(biāo)準(zhǔn)品分別注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄HPLC譜圖。色譜圖見(jiàn)圖3。

考慮到基于UDP/IP棧的《RSSP-I安全協(xié)議》源自于阿爾斯通公司的《FSFB/2安全協(xié)議》，已廣泛應(yīng)用于大鐵路信號(hào)系統(tǒng)軌旁設(shè)備之間的安全通信，因此互聯(lián)互通CBTC系統(tǒng)車(chē)地安全通信解決方案直接采用《RSSP-I安全協(xié)議》來(lái)執(zhí)行安全通信，并分別部署在與功能安全相關(guān)的車(chē)載和地面信號(hào)設(shè)備中。

圖3 二精方顆粒多糖類成分HPLC色譜圖

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄甘露糖、葡萄糖峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葡萄糖回歸方程為y=5114.2x-212.52(r=0.9998，n=6)；得甘露糖回歸方程為y=5839.1x - 369.59(r=0.9996，n=6)。表明葡萄糖和甘露糖分別在0.17~4.18 mg/mL、0.19 ~4.75 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.4.2 精密度考察

精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄面積，結(jié)果，甘露糖、葡萄糖RSD值為0.74%、0.31%。

2.3.4.3 穩(wěn)定性考察

精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果，甘露糖、葡萄糖RSD為0.35%、0.26%。

2.3.4.4 重復(fù)性考察

取同一批次顆粒，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果，甘露糖、葡萄糖RSD為0.39%、0.22%。

精密稱取已知含量樣品6份，分別加入“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，甘露糖和葡萄糖RSD分別為0.14%、0.29%(n=6)，表明加樣回收率良好。

2.4 二精方中黃酮類成分的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

安捷倫 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈：水：冰乙酸 =5：94.5：0.5(A)和乙腈：水：冰乙酸 =70：29.5：0.5(B)；梯 度 洗 脫 條 件：0-14 min：100%-86%(A)；14-22 min：86%-84%(A)；22-40 min：84%-70%(A)；40-60 min：70%-100%(A)；流速為 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為 10 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁，置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至10 mL。過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，加入乙醇，超聲提取兩次，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)HPD-600型大孔樹(shù)脂，蒸餾水除去水溶性雜質(zhì)后，50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，微孔濾膜過(guò)濾，即得。

將制備的供試品與標(biāo)準(zhǔn)品分別注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄HPLC譜圖。色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 二精方顆粒黃酮類成分HPLC色譜圖

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋，得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取上述溶液1 μL進(jìn)樣，記錄蘆丁峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得蘆丁回歸方程為y=24349x+31.064(r=1.0000，n=6)。結(jié)果，表明蘆丁在0.16~8.00 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.4.2 精密度考察

精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，RSD值為2.53%。

2.4.4.3 穩(wěn)定性考察

精密吸取供試品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h 分別進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果，RSD為2.04%。

2.4.4.4 重復(fù)性考察

取同一批次顆粒，按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果，RSD為3%。

2.4.4.5 加樣回收率考察

精密稱取已知含量樣品6份，分別加入“2.4.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，蘆丁RSD為0.56%(n=6)，表明加樣回收率良好。

2.5 二精方顆粒含量測(cè)定

取三批次枸杞-黃精顆粒樣品，按上述含量測(cè)定的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算葡萄糖、甘露糖、蘆丁含量，結(jié)果見(jiàn)表。根據(jù)三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果可知，葡萄糖的平均含量為3.94 mg/袋，甘露糖為0.27 mg/袋，蘆丁為0.06 mg/袋。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

二精方顆粒處方中以枸杞和黃精中的多糖類和黃酮類活性成分作為含量測(cè)定的主要指標(biāo)。研究表明，白素芬[10]等

表1 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

人研究二精丸多糖可明顯降低糖尿病大鼠血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)含量，對(duì)糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀有所緩解。王偉[11]等研究表明寧夏枸杞總黃酮能使損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化作用顯著提高，對(duì)糖尿病引起的心血管疾病具有一定調(diào)節(jié)功能。除此之外，本研究在前期的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立枸杞-黃精提取物化學(xué)成分指紋圖譜和譜效關(guān)系，確定其共有峰并鑒定出多糖類物質(zhì)有葡萄糖和甘露糖[12]，黃酮類物質(zhì)有蘆??；經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定葡萄糖、甘露糖以及蘆丁可能為發(fā)揮降糖作用的有效成分。因此，研究通過(guò)測(cè)定樣品中葡萄糖、甘露糖、蘆丁的含量來(lái)對(duì)二精方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制，并進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，該方法穩(wěn)定可行。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)3批二精方顆粒樣品的含量測(cè)定結(jié)果顯示，葡萄糖的平均含量為3.94 mg/袋，甘露糖為0.27 mg/袋，蘆丁為0.06 mg/袋。擬制定含量限度為：二精方顆粒每袋以葡萄糖(C6H12O6)計(jì)，不得少于3.9320 mg；每袋按甘露糖(C6H12O6)計(jì)，不得少于0.2714 mg。每袋按蘆丁(C27H30O16)計(jì)，不得少于0.0604 mg。