生姜瀉心湯高效液相色譜指紋圖譜的建立

章從恩，王煥君，于小紅，張學強，李 月，趙奎君，馬致潔

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050)

生姜瀉心湯是臨床常用的經(jīng)典方劑，出自《傷寒論》第157條“傷寒汗出解之后，胃中不和，心下痞鞕，干噫食臭，脅下有水氣，腹中雷鳴下利者，生姜瀉心湯主之”[1]。生姜瀉心湯由半夏瀉心湯減干姜二兩，加生姜四兩而成，其原方組成為生姜(四兩)、半夏(半升)、人參(三兩)、黃芩(三兩)、甘草(三兩，炙)、黃連(一兩)、干姜(一兩)和大棗(十二枚，劈)，共8味藥材。方中重用生姜，取其和胃降逆、宣散水氣而消痞滿；配合黃連、黃芩、半夏和干姜辛開苦降、散結(jié)消痞；人參、大棗等補益脾胃；故能治水熱互結(jié)于中焦、脾胃升降失常所致的痞證[2-4]。目前，生姜瀉心湯在臨床上的應用非常廣泛，主要被用于治療腸胃炎[5-6]、消化不良[7-8]、嘔吐[9-10]、結(jié)直腸癌[11]和泄瀉(腹瀉)[12-14]等癥，其治療消化系統(tǒng)疾病的療效確切[6,15]。目前對于生姜瀉心湯的研究主要集中在臨床應用及藥理藥效方面，對于其質(zhì)量控制方法尤其是色譜指紋圖譜方法未見報道，亟待建立完善的生姜瀉心湯質(zhì)量控制方法，為其臨床應用及藥理藥效研究提供參考。本研究通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立生姜瀉心湯的色譜指紋圖譜，為生姜瀉心湯的質(zhì)量控制提供科學參考。

1 材料

1.1 儀器

液相色譜串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜(LC-IT-TOF-MS)，自動進樣器，柱溫箱，UV檢測器(日本島津公司)；LC-MS solution工作站；5424R小型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf)； XS205型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52 A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水真空泵(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司)；移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 藥材

實驗所用藥材法半夏、炙甘草、黃芩、干姜、黃連和大棗購于首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，人參購于盛實百草藥業(yè)有限公司，生(鮮)姜購于北京人衛(wèi)中藥飲片廠。經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，法半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖的炮制加工品；炙甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制品；黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根炮制品；生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖炮制品；干姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖炮制品；黃連為毛茛科植物云連CoptisteetaWall.的干燥根莖炮制品；人參為五加科植物人參PanaxginsengC. A. Mey的干燥根和根莖炮制品；大棗為鼠李科植物棗ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果實。各藥材具體來源和批號見表1。

表1 8味藥材的產(chǎn)地和批號Tab 1 Origin areas and batch numbers of 8 kinds of traditional Chinese medicine

1.3 藥品與試劑

對照品：綠原酸(批號為140730，含量≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司)；甘草苷(批號為111610-201607，含量以93.1%計，中國食品藥品檢定研究院)；姜黃素(批號為0823-9802，中國食品藥品檢定研究院)；6-姜辣素(批號為111833-201806，含量≥99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；黃芩素(批號為491-67-8，含量≥98%，中國藥品生物制品檢驗所)；漢黃芩素(批號為153-18-4，含量≥98%，中國藥品生物制品檢驗所)；黃芩苷(批號為110715-201016，含量以94.0%計，中國藥品生物制品檢驗所)；鹽酸小檗堿(批號為110713-201814，含量≥86.7%，中國食品藥品檢定研究院)；黃連堿(批號為B20560，含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司)。水為屈臣氏蒸餾水；甲醇、甲酸為色譜純(Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸甲醇溶液(B)，按照表2進行梯度洗脫。流速為0.8 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為10 μl。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedures

2.2 供試品溶液的制備

參照《傷寒論》第157條生姜瀉心湯藥味組成及配比，經(jīng)過改進后制備生姜瀉心湯水提液。準確稱取生姜12 g，人參9 g，黃芩9 g，炙甘草9 g，法半夏9 g，干姜3 g，黃連3 g，大棗9 g，置于圓底燒瓶中，加8倍量水充分浸潤，放置浸泡用3層紗布過濾，濾渣加6倍量水微沸回流提取20 min，過濾，合并2次的濾液，濃縮至50 ml，得生藥質(zhì)量濃度為1.26 g/ml，4 ℃冷藏備用。取生姜瀉心湯藥液，加適量超純水稀釋至0.1 g/ml，渦旋1 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。參考文獻，將處方中的8種藥材按不同產(chǎn)地和批號進行排列組合，投藥制備得到10批生姜瀉心湯[16-17]。排列組合結(jié)果見表3；具體藥材來源組成見表1。10批生姜瀉心湯(S1—S10)分別按照上述方法制備供試品溶液。

表3 10批生姜瀉心湯藥材來源批號隨機分組表Tab 3 Random source table of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

2.3 對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成對照品溶液(綠原酸100 μg/ml，甘草苷70 μg/ml，黃連堿100 μg/ml，鹽酸小檗堿25 μg/ml，黃芩苷200 μg/ml，黃芩素25 μg/ml，漢黃芩素90 μg/ml，6-姜辣素30 μg/ml，姜黃素30 μg/ml)，以0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗：取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄圖譜。

2.4.2 重復性試驗：按“2.2”項下供試品溶液制備方法，平行制備S1生姜瀉心湯供試品溶液6份(S1-1—S1-6)，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄圖譜。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：將供試品溶液S1分別在0、2、4、8、12和24 h按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

將混合對照品溶液按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。取10批生姜瀉心湯(S1—S10)按照“2.1”項下的方法進行測定，記錄色譜圖。按照《中藥色譜指紋圖譜》要求，將10批生姜瀉心湯供試品溶液的圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)”進行分析，對峰面積較大、分離度較好的色譜峰進行標定。

3 結(jié)果

3.1 方法學考察結(jié)果

3.1.1 參照峰的選擇：在生姜瀉心湯的指紋圖譜中，選擇峰面積較大而且穩(wěn)定、分離度較好的5個峰(1號、6號、18號、27號和31號峰)作為指紋圖譜方法學考察的參照峰，且上述峰分布在指紋圖譜的整個時間段內(nèi)。在以下的方法學考察研究中，均以各供試品溶液色譜圖中的1號、6號、18號、27號和31號色譜峰為參照峰，計算其保留時間的RSD和峰面積的RSD。

3.1.2 精密度考察結(jié)果：記錄6次進樣的色譜圖，將數(shù)據(jù)導入指紋圖譜相似度評價軟件進行處理，進行色譜峰匹配，6次進樣的圖譜與對照圖譜相似度均>0.998。計算各參照峰保留時間的RSD，結(jié)果均<0.38%；計算其峰面積的RSD，結(jié)果均<2.95%；表明該方法精密度良好，符合特征圖譜相關(guān)要求。精密度考察結(jié)果見表4—5。

表4 精密度考察結(jié)果(保留時間)(n=6)Tab 4 Precision test results(retention time)(n=6)

3.1.3 重復性考察結(jié)果：記錄6次進樣的色譜圖，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)”進行處理，進行色譜峰匹配，6次進樣圖譜與對照圖譜相似度均>0.995。計算各參照峰保留時間的RSD，結(jié)果均<1.30%；計算其峰面積的RSD，結(jié)果均<4.81%；表明該方法的重復性好，符合特征圖譜相關(guān)要求。重復性考察結(jié)果見表6—7。

表5 精密度考察結(jié)果(峰面積)(n=6)Tab 5 Precision test results(peak area) (n=6)

表6 重復性考察結(jié)果(保留時間)(n=6)Tab 6 Repeatability test results (retention time) (n=6)

表7 重復性考察結(jié)果(峰面積)(n=6)Tab 7 Repeatability test results (peak area) (n=6)

3.1.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果：記錄6次進樣的色譜圖，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2 004 A版)”進行處理，進行色譜峰匹配，6次進樣圖譜與對照圖譜相似度均>0.997。計算各參照峰保留時間的RSD，結(jié)果均<0.55%；計算其峰面積的RSD，結(jié)果均<4.37%；表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合特征圖譜相關(guān)要求。穩(wěn)定性考察結(jié)果見表8—9。

表8 穩(wěn)定性考察結(jié)果(保留時間)(n=6)Tab 8 Stability test results (retention time) (n=6)

表9 穩(wěn)定性考察結(jié)果(峰面積)(n=6)Tab 9 Stability test results (peak area) (n=6)

3.2 指紋圖譜的構(gòu)建

將10批藥材的供試品溶液在上述色譜條件下進行分析，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)”進行處理，以S1為參照譜，采用平均數(shù)法，時間窗寬度設定為0.1，多點校正，色譜峰自動匹配，生成對照指紋圖譜，并計算相似度?；旌蠈φ掌稨PLC圖見圖1。生姜瀉心湯HPLC指紋圖譜見圖2(編號S1—S10為10批樣本的液相色譜，R為對照指紋圖譜)，共標定出41個共有峰。

圖2 10批生姜瀉心湯指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

3.3 指紋圖譜相似度評價

指紋圖譜相似度越接近1，說明色譜圖間相似度值越高。10批生姜瀉心湯指紋圖譜相似度見表10。由表10可見，10批樣品的相似度都>0.99，表明不同批次生姜瀉心湯之間相似度良好，質(zhì)量穩(wěn)定，說明用于后期藥效實驗的生姜瀉心湯品具有較好的穩(wěn)定性，同時該指紋圖譜可為生姜瀉心湯藥理藥效實驗的重復性提供參考。

表10 10批生姜瀉心湯指紋圖譜相似度Tab 1 0 Similarity of chromatographic fingerprint of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

4 討論

本研究中，生姜瀉心湯供試品制備方法參考傳統(tǒng)煎煮方法。同時，前期考察了不同流動相梯度洗脫系統(tǒng)(乙腈-水、甲醇-水和0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸溶液)、不同柱溫(20、25、30和40 ℃)和不同流動相流速(0.6、0.8和1 ml/min)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相為0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水，柱溫為40 ℃，流動相流速為0.8 ml/min的分離效果最好，故選擇上述條件進行分析。

10.綠原酸；17.甘草苷；20.黃連堿；24.鹽酸小檗堿；27.黃芩苷；33.黃芩素；34.6-姜辣素；38.漢黃芩素；39.姜黃素10. chlorogenic acid; 17. glycyrrhizin; 20. baicalin; 24. berberine hydrochloride; 27. baicalin；33. baicalein; 34. 6-curcumin; 38. wogonin; 39. curcumin圖1 混合對照品HPLC圖Fig 1 HPLC of mixed reference

本研究應用HPLC法成功建立了生姜瀉心湯指紋圖譜，標定了41個共有峰，并通過對照品對比確認了綠原酸、甘草苷、黃連堿、鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、6-姜辣素和姜黃素9個共有峰；查閱文獻可知，綠原酸來自于大棗[18]，甘草苷來自于甘草，黃連堿、鹽酸小檗堿來源于黃連[19-20]，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素來源于黃芩[21]，6-姜辣素、姜黃素來源于生姜和干姜[22]。另外，生姜瀉心湯中人參為貴重藥材，其成分的指認非常重要，但是本研究中人參主要成分為末端吸收、紫外吸收低且干擾大[23-24]，故暫未進行分析。本研究也未發(fā)現(xiàn)半夏的指標性成分，尚不能體現(xiàn)其專屬性成分。在后續(xù)研究中將進一步采用質(zhì)譜檢測器并重點對親水性成分進行研究，建立更加全面的生姜瀉心湯液相指紋圖譜分析方法。

本研究進行了精密度、重復性和穩(wěn)定性等方法學考察，結(jié)果表明，所用色譜方法符合指紋圖譜技術(shù)定性研究要求；10批生姜瀉心湯相似度>0.95，表明不同批次的生姜瀉心湯之間相似度良好，質(zhì)量穩(wěn)定。表明該方法可以為生姜瀉心湯的質(zhì)量控制提供參考，保證后期藥效學實驗所用的生姜瀉心湯質(zhì)量穩(wěn)定，為實驗的重復性作參考，且對生姜瀉心湯的臨床應用有重要意義。