基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究二仙湯治療乳腺癌的作用機(jī)制Δ

房立源，李慧杰，王志鵬，李秀榮#

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南 250014)

國(guó)家癌癥中心最新發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌發(fā)病率為17.10%，在女性腫瘤中居首位，患者數(shù)約為30.4萬(wàn)例，且具有發(fā)病率逐年升高和年輕化的趨勢(shì)[1-2]。乳腺癌屬于中醫(yī)“乳巖”“乳核”和“石奶”等疾病范疇，乳腺癌中醫(yī)辨證分型有沖任失調(diào)、肝郁氣滯、正虛毒熾、肝腎陰虛和氣陰兩虛5種證型，其中沖任失調(diào)證是臨床上最常見(jiàn)的中醫(yī)證型，治療方劑常選用二仙湯。二仙湯由仙靈脾、仙茅、知母、巴戟天、當(dāng)歸和黃柏6味中藥組成，方中仙茅、仙靈脾和巴戟天溫補(bǔ)腎陽(yáng)、益腎生精，知母、黃柏滋陰泄火，當(dāng)歸滋陰養(yǎng)血、調(diào)理沖任。近年來(lái)，中醫(yī)藥成為乳腺癌全周期治療過(guò)程中的重要組成部分。中醫(yī)藥治療乳腺癌的效果顯著，尤其是在減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3-4]、防治腫瘤及治療相關(guān)并發(fā)癥[5-6]和提高患者生活質(zhì)量[7-8]等方面得到了越來(lái)越多的認(rèn)可和支持。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)逐漸成為新型的疾病-藥物預(yù)測(cè)模型。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集二仙湯的活性成分和靶點(diǎn)，分析預(yù)測(cè)其作用于乳腺癌的潛在機(jī)制，驗(yàn)證活性成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度，為二仙湯在臨床上的廣泛使用提供更多有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 二仙湯活性成分的收集和篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/uniprot/)中獲取二仙湯藥物活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)。其篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。

1.2 乳腺癌作用靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards(https: //www. genecards.org /)、OMIM (https: //www. omim.org /)和CTD(https：//ctdbase. org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索主題詞為“Breast Cancer”，檢索并篩選乳腺癌相關(guān)的作用基因。去除重復(fù)項(xiàng)后，利用Venny 2.1在線工具進(jìn)行二仙湯作用靶點(diǎn)和乳腺癌靶點(diǎn)的映射并繪制韋恩圖。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將二仙湯活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.1軟件，繪制“二仙湯活性成分-作用靶點(diǎn)-乳腺癌”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)表示作用靶點(diǎn)、活性成分、乳腺癌或藥物組成，邊表示兩者之間具有相互作用。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將二仙湯作用靶點(diǎn)和乳腺癌疾病靶點(diǎn)交集部分輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://string-db.org/)，選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)定相互作用閥值為“medium confidence=0.4”，并隱藏游離節(jié)點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)和蛋白模塊分析

運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件對(duì)“1.4”項(xiàng)下獲得的網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算網(wǎng)絡(luò)圖整體的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和點(diǎn)度中心性(degree Centrality，DC)，以BC、CC和DC的平均數(shù)為閾值，選取BC、 CC和DC同時(shí)在閾值之上的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件的MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要蛋白模塊。

1.6 富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言把二仙湯-乳腺癌的共有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成entrezlD，加載“BiocManager”和“clusterProfiler”等程序包，運(yùn)行R語(yǔ)言獲得基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析的氣泡圖。最后運(yùn)用Perl語(yǔ)言把entrezlD 轉(zhuǎn)換為基因靶點(diǎn)信息。根據(jù)生物過(guò)程分析和通路富集結(jié)果，對(duì)二仙湯治療乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

選取二仙湯的主要活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載化合物結(jié)構(gòu)，并保存為mol2格式。利用PYMOL軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水除配體，運(yùn)行AutoDock 1.5.6軟件將活性成分及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫、加電荷，再運(yùn)行Auto dock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，使用PYMOL軟件把對(duì)接結(jié)果進(jìn)行圖片展示[9]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物和靶標(biāo)之間結(jié)合自由能<-5 kcal/mol被認(rèn)為具有較好作用[10]。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯的活性成分和作用靶點(diǎn)

在TCMSP中根據(jù)檢索條件檢索仙茅、仙靈脾、巴戟天、知母、黃柏和當(dāng)歸的有效成分，去除重復(fù)項(xiàng)后，共篩選出符合條件的活性成分93個(gè)，作用靶點(diǎn)154個(gè)。運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件對(duì)活性成分進(jìn)一步分析，度值(Degree)排序居前10位的活性成分見(jiàn)表1。

表1 二仙湯活性成分(度值排序居前10位)Tab 1 Active components of Erxian decoction(top 10，ranked by Degree value)

2.2 乳腺癌的作用靶點(diǎn)

以“Breast Cancer”為關(guān)鍵詞在Gene Cards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索內(nèi)容，刪除重復(fù)項(xiàng)，最終尋找到疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因364個(gè)，并將二仙湯作用靶點(diǎn)和乳腺癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射并繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 Venny圖Fig 1 Venny diagram

2.3 藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件繪制“二仙湯-成分-靶點(diǎn)-乳腺癌”網(wǎng)絡(luò)圖，二仙湯的64個(gè)藥效成分通過(guò)調(diào)控40個(gè)靶點(diǎn)治療乳腺癌。從網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，二仙湯活性成分和靶點(diǎn)存在一對(duì)多的關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of “drug-component-target-disease”

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將二仙湯作用靶點(diǎn)與乳腺癌作用靶點(diǎn)的交集基因(40個(gè))導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)互相作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)和蛋白模塊分析

通過(guò)Cytoscape Version 3.7.1計(jì)算得到，PPI網(wǎng)絡(luò)中度值平均數(shù)為18.25，間距中心度平均數(shù)為0.014，緊密中心度平均數(shù)為0.665，將節(jié)點(diǎn)的度值、緊密中心度和間距中心度均>其平均數(shù)的節(jié)點(diǎn)基因作為核心靶基因，共獲得核心靶點(diǎn)基因12個(gè)，運(yùn)用Cytoscape Version 3.7.1軟件的MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白模塊，以度值=2，節(jié)點(diǎn)得分=0.2，k-core=2，最大深度=100作為篩選參數(shù)，篩選得到3個(gè)重要蛋白模塊，見(jiàn)圖4—5。

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Network diagram of core target

圖5 重要蛋白模塊Fig 5 Modules of important protein

2.6 富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：對(duì)40個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能富集分析，共有1 502條GO數(shù)據(jù)條目(P<0.05)。生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)條目數(shù)最多，共有1 401個(gè)，根據(jù)通路上富集到靶點(diǎn)數(shù)目多少來(lái)看，主要集中在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)和對(duì)活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen specise)；分子功能(molecular function，MF)相關(guān)條目有75個(gè)，主要涉及到血紅素結(jié)合(heme binding)、四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)和氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)；細(xì)胞組成(cell component，CC)相關(guān)條目有26個(gè)，主要有細(xì)胞膜筏(membrane raft)和細(xì)胞膜微區(qū)(membrane microdomain)，見(jiàn)圖6—8。

圖6 生物學(xué)過(guò)程GO功能富集分析Fig 6 GO function enrichment analysis of biological process

圖7 分子功能GO功能富集分析Fig 7 GO function enrichment analysis of molecular function

圖8 細(xì)胞組成GO功能富集分析Fig 8 GO function enrichment analysis of cell component

2.6.2 KEGG通路富集分析：對(duì)40個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，共得到101條代謝通路(P<0.05)。二仙湯治療乳腺癌主要涉及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)和PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-AKT signaling pathway)，見(jiàn)圖9。

圖9 KEGG通路富集分析Fig 9 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接結(jié)果顯示，二仙湯主要活性成分quercetin、kaempferol、Isocorypalmine和beta-sitosterol與TP53、IL-6和JUN均具有較好的結(jié)合力，其中TP-53與活性成分的結(jié)合較為緊密，見(jiàn)圖10—11。

圖10 分子對(duì)接結(jié)果Fig 10 Results of molecular docking

3 討論

清代名醫(yī)陳實(shí)功在其著作《外科正宗》[11]中描述為“乳巖乃憂郁傷肝，思慮傷脾，積想在心……其時(shí)五臟俱衰，四大不救，名曰乳巖”。由此可見(jiàn)，乳巖的發(fā)生大多是憂郁思慮等情志所傷，臟腑功能失調(diào)，濕聚痰凝，氣滯血瘀，煉液成核，發(fā)為腫塊。著名中醫(yī)婦科學(xué)家夏桂成教授認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)生與腎密切相關(guān)，主張腎氣虧虛是其主要的病因[12]。乳腺癌的病位雖在乳房，但是與肝、脾和腎等臟腑關(guān)系緊密，病機(jī)主要涉及肝脾不調(diào)、痰濕瘀毒、沖任失調(diào)和氣血虧虛等方面，在治療上多采用扶正祛邪、調(diào)和肝脾、解毒散結(jié)和調(diào)理沖任等治療原則。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)，探討二仙湯治療乳腺癌的可能作用機(jī)制。在二仙湯活性成分中，槲皮素、山柰酚、異延胡索單酚堿和β-谷甾醇為核心化合物。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖，阻斷惡性腫瘤細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和侵襲，且隨著槲皮素濃度升高，抗腫瘤作用增強(qiáng)[13]。槲皮素可逆轉(zhuǎn)乳腺癌非甾體類抗雌激素治療藥物他莫昔芬的耐藥性[14]。李鷹飛等[15]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明，山柰酚在體外條件下可抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。趙明智等[16]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚可通過(guò)抑制PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)人炎性乳腺癌SUM190細(xì)胞株凋亡。閆倩等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異延胡索單酚堿具有較好的抗腫瘤作用。孫玉成等[18]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β-谷甾醇可通過(guò)PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。陶仕英等[19]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，高濃度β-谷甾醇可直接將ER陽(yáng)性人乳腺癌T47D細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖。

圖11 TP-53與活性成分的分子對(duì)接Fig 11 Molecular docking of TP-53 with active components

在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，TP-53、IL-6和JUN處于核心地位。TP-53是一種抑癌基因，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、修復(fù)和凋亡等發(fā)揮抗惡性腫瘤作用[20]；當(dāng)其發(fā)生基因突變時(shí)，其在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[21]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TP-53基因突變的女性人群中，60歲時(shí)乳腺癌累計(jì)發(fā)病率接近85%，多見(jiàn)于三陰性乳腺癌和Her-2陽(yáng)性的乳腺癌患者[22-23]。高IL-6水平與乳腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，IL-6水平可作為早期診斷、病情研判和預(yù)后評(píng)價(jià)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[24]；并且，激活的IL-6信號(hào)通路能增強(qiáng)Her-2陽(yáng)性乳腺癌對(duì)曲妥珠單抗的耐藥性，降低治療效果[25]。JUN(轉(zhuǎn)錄因子AP-1)與高侵襲性乳腺癌相關(guān)，現(xiàn)有研究結(jié)果證實(shí)，JUN及其受體有希望成為新的免疫治療靶點(diǎn)[26-27]。分子對(duì)接結(jié)果表明，核心化合物與靶點(diǎn)間均具有很好的結(jié)合力，其中槲皮素、山柰酚、異延胡索單酚堿和β-谷甾醇與TP-53的結(jié)合力最強(qiáng)，進(jìn)一步提示TP-53很有可能成為二仙湯治療乳腺癌的重要靶點(diǎn)。

進(jìn)一步的富集分析結(jié)果顯示，二仙湯治療乳腺癌涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，主要集中在細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)和氧化還原酶活性等；代謝通路富集通路分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集在流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路，乳腺癌、內(nèi)分泌抵抗和癌癥中的蛋白多糖等代謝途徑。這些代謝通路均與乳腺癌的形成和發(fā)展密切相關(guān)。流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路可調(diào)節(jié)腫瘤血管的再生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[28]。PI3K-AKT信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移方面也起到重要作用[29]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)二仙湯中化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)進(jìn)行了探討，從中可以得出二仙湯治療乳腺癌具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路等特點(diǎn)。二仙湯的主要化合物槲皮素、山柰酚、異延胡索單酚堿和β-谷甾醇，可能以TP-53、IL-6和JUN為主要作用靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、參與血管再生和PI3K-AKT/MAPK信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮作用。