甜蕎種子多倍體誘導(dǎo)及其C1代DNA與形態(tài)學(xué)鑒定

李德利，代雙容，賈妍恒，楊黎明，高金鋒，王鵬科

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100)

蕎麥，蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopy-rumMill)，別名凈腸草、烏麥、三角麥等，是蓼科作物中唯一的糧用植物，與水稻、小麥等禾本科大宗作物不同，蕎麥?zhǔn)且环N營(yíng)養(yǎng)豐富且藥食同源的小宗糧食作物[1]。甜蕎生育期短，耐旱、耐寒、耐瘠薄，是我國(guó)西北、華北、東北一些干旱半干旱地區(qū)重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物[2]，含有豐富蛋白質(zhì)、膳食纖維以及黃酮類化合物，可用于治療炎癥性疾病、高血壓和糖尿病[3-5]。目前對(duì)于蕎麥的研究，主要集中在其化學(xué)成分含量、生產(chǎn)狀況、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及雜交育種等方面[6-9]，而關(guān)于蕎麥多倍體育種方面的研究還不廣泛。

多倍體育種大多是經(jīng)過(guò)自然變異和人工誘變這兩種途徑產(chǎn)生，其目的皆是為了創(chuàng)造新類型、新物種和選育符合人們需要的優(yōu)良品種。我國(guó)的蕎麥多倍體研究起步較晚，鄭丕堯和崔繼林于20世紀(jì)40年代利用秋水仙素成功誘導(dǎo)出甜蕎多倍體，但未能在生產(chǎn)上應(yīng)用[10]。高立榮等[11]利用棉球滴定處理蕎麥生長(zhǎng)點(diǎn)的方法，獲得了甜蕎的同源四倍體‘混選四號(hào)’。朱必才等[12]通過(guò)對(duì)比同源四倍體蕎麥和二倍體普通蕎麥，發(fā)現(xiàn)兩者的外部形態(tài)和細(xì)胞學(xué)特征有所不同，四倍體蕎麥株高增加，葉片變大、增厚且保衛(wèi)細(xì)胞和根尖分生組織細(xì)胞皆增大，花器、花粉粒、籽粒均顯著變大，并且染色體由普通蕎麥的2n=2x=16加倍成了2n=4x=32。趙鋼等[13-14]同樣利用棉球滴定法對(duì)苦蕎開(kāi)展染色體加倍研究，認(rèn)為同源四倍體苦蕎新品系(4x)的細(xì)胞和組織器官比原種(Zx)明顯增大，并且新品系中的各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高于原種，之后又使用秋水仙素混合二甲基亞砜溶液處理九江苦蕎進(jìn)行加倍處理，選育出同源四倍體苦蕎新品系97-1[15]。而后，趙鋼等[16]又利用60Co-γ射線前期處理，加之秋水仙堿混合二甲基亞砜溶液浸泡苦蕎品種額落烏且的種子，得到早熟、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)的西蕎1號(hào)。吳清等[17]通過(guò)秋水仙素溶液對(duì)帶綠色芽點(diǎn)愈傷組織的金蕎麥進(jìn)行浸泡處理，能夠產(chǎn)生多倍體金蕎麥。廉立坤[18]也采用秋水仙素混合二甲基亞砜溶液，使用棉球滴定法，對(duì)苦蕎進(jìn)行染色體加倍，并且成功誘導(dǎo)出12個(gè)同源四倍體苦蕎品系。李秀蓮等[19]又通過(guò)上述方法處理晉蕎麥3號(hào)，選育出四倍體甜蕎新品系T40-8，該新品系能夠提高甜蕎的單產(chǎn)、出米率和出粉率。

甜蕎由于花器小而脆弱以及異花授粉特性限制了其雜交育種，長(zhǎng)期的系統(tǒng)選育也導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)狹窄，新的種質(zhì)類型缺乏，加之育種技術(shù)發(fā)展較慢，生產(chǎn)品種混雜、退化，嚴(yán)重影響我國(guó)蕎麥的質(zhì)量和產(chǎn)量[20-21]。本文是利用秋水仙素處理甜蕎萌發(fā)種子，通過(guò)對(duì)萌發(fā)后代(C1)DNA的相對(duì)含量、形態(tài)學(xué)、氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞等特征鑒定，探討甜蕎種子誘導(dǎo)多倍體及其鑒定的體系方法，以期誘導(dǎo)出甜蕎多倍體植株，獲得多倍體種質(zhì)資源，并選育符合生產(chǎn)需要的優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

處理的甜蕎種子為西北農(nóng)林科技大學(xué)雜糧實(shí)驗(yàn)室選育的西農(nóng)T1401(紅花甜蕎)，對(duì)處理種子萌發(fā)后的植株(C1)用美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Flow cytometric)鑒定其DNA相對(duì)含量，得到多倍體甜蕎，并與二倍體甜蕎對(duì)比形態(tài)學(xué)特征、氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞特征。

1.2 研究方法

1.2.1 多倍體誘導(dǎo)處理 選用大而飽滿的甜蕎種子，提前浸泡12 h，置于發(fā)芽盒內(nèi)于28℃培養(yǎng)箱中長(zhǎng)至種子露白(胚根長(zhǎng)度≤0.5 cm)，分別以0.1%(A1)、0.2%(A2)的秋水仙素溶液避光浸泡處理露白種子6、9、12、18、24 h(B1～B5)，每個(gè)處理100粒種子，清水處理為對(duì)照(表1)。

表1 秋水仙素誘導(dǎo)多倍體甜蕎的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of polyploid common buckwheat treated with colchicine

浸泡處理完成后，用蒸餾水洗凈種子上殘留的秋水仙素溶液，用鑷子逐粒播種于內(nèi)口徑28 cm的花盆中，每個(gè)花盆20粒種子，每個(gè)處理5個(gè)花盆。出苗后，根據(jù)秋水仙素處理后成活株數(shù)計(jì)算成苗率，之后進(jìn)行常規(guī)水肥管理。

成苗率(%)=出苗株數(shù)/處理種子總數(shù)×100%

1.2.2 多倍體植株鑒定 待植株長(zhǎng)至7～8葉后，根據(jù)之前標(biāo)記的變異苗植株，選取甜蕎對(duì)照株和變異株的中部新鮮葉片，置于提前預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞解離液，用刀片將葉片快速切碎，于冰上靜置5～10 min，期間輕輕吹打幾次，使葉片與細(xì)胞解離液充分混合，之后用移液槍吸取上清液800 μL，用300目的篩網(wǎng)過(guò)濾到1.5 ml的離心管中，加入DAPI染色液染色5 min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，參照汪艷[22]等和Obidiegwu[23]等描述的流式細(xì)胞儀鑒定方法，以二倍體甜蕎植株為對(duì)象，判斷變異植株的倍性，并根據(jù)流式細(xì)胞儀鑒定獲得的變異株數(shù)計(jì)算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率(%)=變異株數(shù)/處理種子總數(shù)×100%

1.2.3 多倍體與二倍體甜蕎形態(tài)特征比較 待處理過(guò)的甜蕎種子出苗后，觀察胚軸、子葉、真葉的狀況，與對(duì)照植株進(jìn)行對(duì)比，將下胚軸增粗、葉片畸形、葉色改變的植株視為變異苗，作為初步鑒定的結(jié)果參考。之后根據(jù)植株密度適當(dāng)進(jìn)行移栽，繼續(xù)進(jìn)行觀察，掛牌標(biāo)記。

直到幼苗長(zhǎng)出7～8片葉后，觀察多倍體甜蕎植株葉片和對(duì)照植株的區(qū)別，主要觀察記錄葉片的形狀(是否皺縮、畸形、葉緣是否完整)以及葉色，做好標(biāo)記。

花期用游標(biāo)卡尺測(cè)量多倍體甜蕎花朵的大小、花瓣長(zhǎng)寬以及最大兩片花瓣間的距離，并用體式顯微鏡拍照，觀察花瓣顏色是否有改變。

成熟期對(duì)甜蕎植株進(jìn)行株高、莖粗、節(jié)間數(shù)、分枝數(shù)等數(shù)據(jù)的測(cè)量收錄以及種子外觀形態(tài)的觀察。

1.2.4 多倍體與二倍體甜蕎氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞特征比較 在觀察植株形態(tài)特征的同時(shí)，選取變異植株中部葉片，清洗干凈，利用掃描電鏡制片法[24]，在靠近葉片主脈的位置，用刀片切割為長(zhǎng)0.5 cm的2～3個(gè)小方塊，進(jìn)行掃描電鏡前處理，之后用鎢燈絲掃描電鏡進(jìn)行觀察拍照，測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞、氣孔的長(zhǎng)、寬以及單位面積氣孔數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對(duì)甜蕎的誘導(dǎo)效應(yīng)

統(tǒng)計(jì)甜蕎在不同濃度秋水仙素和浸泡處理時(shí)間下的誘導(dǎo)效果，通過(guò)成苗率可知(表2)，當(dāng)處于同一濃度處理下時(shí)，秋水仙素對(duì)種子的毒害作用隨著其浸泡處理時(shí)間的增加而增加；反之，當(dāng)浸泡處理時(shí)間相同，種子的成苗率也會(huì)隨著秋水仙素濃度的增加而降低。而由誘導(dǎo)率可知(表2)，以A2B3處理組合的誘導(dǎo)率最高，為80%，該處理組合共誘導(dǎo)獲得4株四倍體植株；其次是A1B5的處理組合，誘導(dǎo)率為75%，共獲得3株四倍體植株；然后是A2B5的處理組合，誘導(dǎo)率為50%，獲得1株四倍體植株。雖然以上處理可以獲得較高的誘導(dǎo)率，但也伴隨著成苗率在下降。因此，在實(shí)際應(yīng)用上應(yīng)當(dāng)加大做誘導(dǎo)處理的種子數(shù)量，以獲得較多的誘導(dǎo)加倍植株。

2.2 多倍體植株的DNA鑒定

通過(guò)對(duì)比3種倍性蕎麥的細(xì)胞核散射光特征(圖1)，其中橫坐標(biāo)(FSC)為前向散射光，反映細(xì)胞核的大?。豢v坐標(biāo)(SSC)為側(cè)向散射光，反映細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度，送檢樣本細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色液染色后出現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞核群，發(fā)射出熒光，之后再根據(jù)相應(yīng)的熒光通道檢測(cè)，得出峰圖并計(jì)算倍性。

經(jīng)流式細(xì)胞儀分析得知(圖2)，以二倍體甜蕎植株為參考(圖2A)，其DNA含量峰值出現(xiàn)在熒光通道100處，而多倍體植株的DNA含量峰值位于熒光通道200處的位置及200～250處之間(圖2B、圖2C)，說(shuō)明多倍體甜蕎植株的DNA含量是二倍體甜蕎植株的2倍及2倍以上。因此，可以判斷出這兩種類型的多倍體植株分別為四倍體、非整倍體甜蕎。

利用流式細(xì)胞儀對(duì)C1群體出苗的所有個(gè)體進(jìn)行DNA檢測(cè)，從成苗的193個(gè)植株中共獲得65株變異植株，其中包括36株四倍體、29株非整倍體(表2)。誘導(dǎo)的加倍植株平均占成苗植株的33.7%，占處理種子數(shù)量的6.5%。

2.3 多倍體甜蕎形態(tài)特征鑒定

2.3.1 幼苗變異特征 根據(jù)出苗情況得知(表2)，經(jīng)過(guò)秋水仙素處理的種子出苗遲緩，且出苗整齊度較差，對(duì)照組種子出苗需3 d，而誘導(dǎo)組出苗需7～12 d，其中在A2B5的處理下種子出苗所需天數(shù)最長(zhǎng)，需要12 d。由圖3可知，當(dāng)子葉展開(kāi)，經(jīng)過(guò)處理的甜蕎種子出現(xiàn)不同的變異特征，如胚軸增粗、兩片子葉葉柄粘連、生長(zhǎng)點(diǎn)受損、子葉顏色變紫等。

表2 不同濃度秋水仙素和處理時(shí)間對(duì)甜蕎的誘導(dǎo)效果Table 2 Effect of different concentration of colchicine and treatment time on induction of common buckwheat

由圖4可知，待3～4片真葉展開(kāi)后誘導(dǎo)組植株出現(xiàn)如下特征：子葉和真葉皺縮且葉緣不齊、根莖節(jié)基部膨大畸形、子葉未發(fā)生畸變而真葉畸形、第二節(jié)間膨大、真葉畸形穿生于葉柄間。

2.3.2 株高、莖粗等形態(tài)特征 對(duì)二倍體、四倍體、非整倍體甜蕎植株的各形態(tài)特征指標(biāo)(株高、莖粗、分枝、節(jié)間數(shù))進(jìn)行方差分析可知(表3)，四倍體、非整倍體甜蕎植株的各形態(tài)指標(biāo)與二倍體之間存在顯著差異。二倍體甜蕎植株的株高、主莖節(jié)數(shù)、分枝數(shù)顯著高于其他兩種倍性的植株，莖粗則顯著低于其他兩種倍性的植株，說(shuō)明秋水仙素對(duì)甜蕎株高有一定的抑制作用，卻使得甜蕎植株的莖粗增加。

表3 3種倍性甜蕎植株的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of three ploidy common buckwheat plants

2.3.3 葉片、根系形態(tài)特征 由圖5可知，與二倍體甜蕎相比，四倍體、非整倍體甜蕎的根系更加發(fā)達(dá)，主根明顯增長(zhǎng)，須根增多，并且四倍體、非整倍體植株的莖粗增加，這便能夠增加甜蕎植株的抗倒伏性。

對(duì)比3種倍性甜蕎植株的葉色、葉型(圖6)發(fā)現(xiàn)，四倍體、非整倍體植株的葉片顏色要比二倍體葉片的顏色深(尤其是非整倍體的葉片顏色呈現(xiàn)出紫色)，另外其葉表粗糙，葉脈明顯，葉緣缺刻不完整，同時(shí)葉片的厚度也有所增加。

2.3.4 花、種子的形態(tài)特征 通過(guò)觀察3種倍性甜蕎的花朵結(jié)構(gòu)特征，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量最大兩片花瓣間的距離、花瓣長(zhǎng)度、花瓣寬度發(fā)現(xiàn)，四倍體、非整倍體甜蕎的最大兩片花瓣間的距離、花瓣長(zhǎng)度、花瓣寬度均顯著大于二倍體甜蕎(圖7)，并且四倍體和非整倍體之間差異不顯著。在體式顯微鏡下觀察甜蕎花朵結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)(圖8)，蕎麥花朵有雄蕊8枚，兩輪排列，內(nèi)圈3枚緊靠雌蕊，外圈5枚分別生長(zhǎng)于兩花瓣的夾角間；雌蕊有3枚，柱頭呈圓形，表面粗糙，凹凸不平。隨著倍性水平的增加，花瓣顏色也逐漸加深，并且各花瓣的大小不一。

與二倍體甜蕎種子相比(圖9)，四倍體、非整倍體甜蕎的種子(C1)在外觀上與其有明顯區(qū)別，種皮顏色呈灰色花紋狀伴有斑點(diǎn)，種子外觀輪廓也要比二倍體種子大，四倍體、非整倍體的百粒重分別為3.48、3.22 g ，分別比二倍體種子增加了0.81、0.55 g。

非整倍體的花器、種子在C1明顯變大，但是否能夠遺傳，還須在C2及以后各代中進(jìn)行鑒定。

2.4 氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞鑒定

二倍體與四倍體、非整倍體甜蕎葉片的保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度，氣孔的長(zhǎng)度、寬度以及單位面積的氣孔數(shù)量均存在顯著性差異 (表4) 。四倍體、非整倍體的保衛(wèi)細(xì)胞、氣孔大小(圖10A～圖10C)與二倍體植株存在顯著差異。于掃描電鏡放大500倍的視野下觀察，二倍體的氣孔數(shù)目平均為16.00個(gè)(圖10D)，四倍體和非整倍體的氣孔數(shù)目分別為7.33、6.67個(gè)(圖10E、圖10F)。這說(shuō)明隨著倍性的增加，單位面積氣孔數(shù)目呈下降趨勢(shì)，但保衛(wèi)細(xì)胞及氣孔大小都顯著增大。

表4 3種倍性甜蕎氣孔比較Table 4 Stomatal comparison of three ploidy buckwheat plants

3 討論與結(jié)論

秋水仙素誘導(dǎo)作為植物加倍誘變處理中常用的方法，其操作簡(jiǎn)單、成功率高。一般秋水仙素的有效濃度在0.01%～0.4%，而以0.2%左右的濃度為最常用[25]，低濃度的秋水仙素以及短時(shí)間的處理皆得不到有效的變異加倍效果，而隨著秋水仙素濃度的增加以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生毒害作用[26]。本試驗(yàn)中，0.2%濃度下浸泡12、18、24 h的種子出苗率很低，分別為5.0%、9.0%、2.0%(而0.2%濃度下浸泡9 h未曾出苗，推測(cè)可能是水分過(guò)多，種子腐爛)。因此，只有適合的濃度和處理時(shí)間才能誘導(dǎo)出多倍體植株。

相較于棉球滴定法，直接用秋水仙素溶液浸泡處理露白種子具有以下優(yōu)勢(shì):(1)簡(jiǎn)單易行、便于操作，而棉球滴定法操作繁瑣，還要求有一定的技術(shù)操作水平，要保證溶液通過(guò)滴管可以準(zhǔn)確無(wú)誤的滴在棉球上；另外，棉球大小影響著多倍體誘導(dǎo)成功與否，棉球過(guò)大，子葉承受不住其重量，容易掉落；棉球過(guò)小，起不到有效的誘導(dǎo)效果。(2)不受天氣、風(fēng)向、苗情等外界環(huán)境的影響，而棉球滴定法中的夾棉球、滴溶液操作，要求在無(wú)風(fēng)的天氣下進(jìn)行；而且，經(jīng)過(guò)幾次前期發(fā)芽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蕎麥出苗后極容易長(zhǎng)成“高腳苗”，這不便于兩片子葉中間夾棉球。(3)誘導(dǎo)效率高，出苗后容易成活。

植物經(jīng)秋水仙素處理后，在細(xì)胞有絲分裂期間通過(guò)抑制紡錘體的形成從而實(shí)現(xiàn)染色體的數(shù)目加倍[27]，細(xì)胞變大，突出表現(xiàn)在根、莖、葉器官上具有巨型性，抗逆性增強(qiáng)。多倍體植株的葉片厚度、氣孔大小、葉綠素含量、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)均高于二倍體植株，而氣孔密度低于二倍體植株[28]。本試驗(yàn)中多倍體甜蕎植株的株高較二倍體矮，但莖粗卻有所增加，且根系發(fā)達(dá)，須根增多；葉表面皺縮粗糙，葉片面積變大，葉色加深；花器變大，顏色鮮艷；氣孔面積變大，單位面積氣孔數(shù)目下降；種子變大，種皮呈灰色花紋，百粒重增加。同源多倍體在減數(shù)分裂過(guò)程中會(huì)發(fā)生染色體的不均等分離，往往導(dǎo)致育性降低，單株粒數(shù)下降。高立榮等[11]對(duì)同源多倍體蕎麥的研究表明，四倍體與二倍體相比較結(jié)實(shí)率有所下降, 但千粒重增大, 單株產(chǎn)量較高。本研究?jī)H對(duì)甜蕎誘導(dǎo)后的C1代植株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)由于甜蕎為異花授粉，受試驗(yàn)條件等所限，加倍材料的育性、單株產(chǎn)量等難以反映出其真實(shí)水平，所以加倍后甜蕎的產(chǎn)量情況需要在C2代以后的穩(wěn)定四倍體植株上測(cè)定。但本試驗(yàn)所用的材料為觀賞性紅花甜蕎，加倍后的植株莖粗增加，根系發(fā)達(dá)，能夠增加植株的抗倒伏性，以及花器變大、顏色鮮艷等這些特征對(duì)于甜蕎觀賞特殊應(yīng)用具有意義。

如何區(qū)別、鑒定多倍體植株是多倍體育種中最核心的重要步驟。主要從以下4個(gè)方面鑒定多倍體植株，即形態(tài)鑒定、氣孔鑒定、染色體計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀測(cè)定等。在實(shí)際應(yīng)用中，形態(tài)鑒定、氣孔鑒定的方法都只是作為多倍體鑒定的間接方法，其鑒定結(jié)果一般只作為參考[29]；最為直接準(zhǔn)確的鑒定方法要屬染色體計(jì)數(shù)法，但該方法操作復(fù)雜，制片過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、要求有較高壓片技術(shù)，對(duì)于本身染色體數(shù)目較多的植物來(lái)說(shuō)[30]，要想大批量鑒定多倍體就比較耗時(shí)、耗材、耗力；流式細(xì)胞術(shù)是鑒定植物倍性最簡(jiǎn)便、快捷，并且能夠大批量檢測(cè)的方法，其能夠測(cè)定出單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)的DNA含量，且其DNA含量變異可在分布圖上直觀地看出，其鑒定多倍體植株的原理是細(xì)胞核DNA含量和染色體數(shù)之間存在著線性關(guān)系，而細(xì)胞核DNA含量又與熒光強(qiáng)度成正比[31]。因此，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞熒光強(qiáng)度而鑒定出植物倍性的方法是可行且可靠的，而且可以快速、直觀地檢測(cè)出非整倍體。

本試驗(yàn)是以甜蕎種子為材料，分別利用0.1%、0.2%濃度的秋水仙素浸泡露白的蕎麥種子進(jìn)行多倍化誘變。研究表明，以0.1%的濃度下浸泡種子12h為蕎麥多倍體誘導(dǎo)的最佳處理。同時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定多倍體植株的倍性，觀察比較甜蕎植株的形態(tài)學(xué)特征和氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞的特征，從而準(zhǔn)確鑒定甜蕎多倍體植株。