注射用頭孢米諾鈉中有關物質HPLC檢測方法的建立與驗證

于涵光，徐亮

（1.天津醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，天津 300070；2.泊諾（天津）創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司，天津 300022）

注射用頭孢米諾鈉（Cefminox Sodium for injection）其處方為頭孢米諾鈉（Cefminox Sodium）的無菌粉末，是頭霉素衍生物，由半合成法制取。合成工藝由倪福震[1]總結王浩等采用了以7-MAC為原料的合成工藝路線[2]，分別經(jīng)歷了7-MAC的酰化，脫羧酸保護基，與D-半胱氨酸鹽酸鹽水合物的縮合制成粗品，重結晶精制；吳志軍等[3]以7-ACA為原料，經(jīng)歷4步合成得到粗品，然后精制而成。頭孢米諾鈉其性質類似于第三代抗生素，具有抗β-內酰胺酶的作用，體內分布廣泛，血藥濃度達峰時間快，幾乎無不良反應，所以，此品種市場競爭力較大[4-6]。頭孢米諾鈉目前收載于中國藥典（CP）、日本藥典（JP）以及相關企業(yè)注冊標準及內控標準中，品種分別為原料和注射劑。《中國藥典》2020年版二部（308頁）收載了原料藥頭孢米諾鈉及其制劑注射用頭孢米諾鈉，有關物質Ⅰ方法質量標準限度中沒有訂出已知雜質?！度毡究股镔|醫(yī)藥品基準解說》中也沒有對頭孢米諾進行已知雜質標準的制定，所以本文通過對工藝及降解途徑的研究，得出潛在已知雜質，然后建立反相HPLC方法，并對方法進行驗證[7-8]。然后對6批樣品進行有關物質的檢測。

1 材料與方法

有關物質信息，筆者研究了頭孢米諾鈉的工藝及降解途徑，得出了5個潛在雜質。其中，雜質1、5為工藝雜質，雜質2、3、4為降解雜質。主成分及各雜質信息見表1。

表1 頭孢米諾鈉中潛在雜質列表Tab 1 List of potential impurities in Cefminox Sodium

其中，雜質1與雜質5為工藝雜質，雜質2為主成分3位側鏈水解產物，雜質3為δ-2位異構化變?yōu)棣?3的產物，雜質4為主成分4位側鏈降解后與溶劑結合產物。筆者得到了各雜質對照品，以《中國藥典》2020年版二部頭孢米諾鈉項下的有關物質方法為基礎，篩選條件，建立方法。

1.1 供試品與對照品 注射用頭孢米諾鈉（韓國Kukje公司，批號：MMX11918X，MMX11919X，MMX11920X，MMX21910X，MMX21911X，MMX21912X）；頭孢米諾對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130508-201604）；頭孢米諾系統(tǒng)適用性對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130607-201802）；頭孢米諾雜質1（商業(yè)定制）；頭孢米諾雜質2（商業(yè)定制）；頭孢米諾雜質3（商業(yè)定制）；頭孢米諾雜質4（商業(yè)定制）；頭孢米諾雜質5（商業(yè)定制）。

1.2 儀器與試劑 安捷倫1260液相色譜儀，Openlab 2.3 CDS工作站；賽多利斯BT125D十萬分之一天平；賽多利斯MSA3.6P百萬分之一天平；布蘭德電子移液槍；甲醇（色譜純）、四氫呋喃（色譜純），冰乙酸（分析純）。

1.3 方法的優(yōu)化

1.3.1 《中國藥典》2020年版色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸溶液（1→100）-甲醇-四氫呋喃（990∶5∶5）為流動相；檢測波長為254 nm；進樣體積10 μL。

1.3.2 色譜柱篩選 按照限度濃度配制主物質與各雜質的混合溶液作為定位溶液（取供試品及各雜質對照品稀釋并溶解制成每1 mL約含頭孢米諾1.0mg，各雜質2 μg的溶液），分別選用安捷倫公司的Zorbax XDB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；Zorbax SB-Aq，250 mm×4.6 mm，5 μm；Zorbax SB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm 3根色譜柱進樣。

1.3.3 雜質穩(wěn)定性考察 取上述定位溶液，連續(xù)進樣6次，計算各雜質峰面積的RSD%。

1.3.4 稀釋劑的優(yōu)化 將稀釋劑由醋酸溶液（1→100）-甲醇-四氫呋喃（990∶5∶5）改為水-甲醇-四氫呋喃（990∶5∶5），按照定位溶液配制方式，連續(xù)進樣6次，計算各雜質峰面積的RSD%。

1.3.5 方法的建立 稀釋劑為水-甲醇-四氫呋喃（990∶5∶5）。取本品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含頭孢米諾1.0 mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）。精密量取適量，用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL中約含頭孢米諾10 μg的溶液，作為對照溶液；精密量取對照溶液1 mL，用稀釋劑定量稀釋制成每1mL中約含頭孢米諾0.5μg的溶液，作為靈敏度溶液。色譜條件為：選用反相色譜柱（Agilent Zorbax SB-Aq，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為冰乙酸水溶液（1→100）-甲醇-四氫呋喃（990:5:5），稀釋劑為水-甲醇-四氫呋喃（990:5:5），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10 μL，檢測波長為254 nm。取靈敏度溶液注入液相色譜儀，主成分峰高的信噪比應大于10。取供試品溶液與對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間約3倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，雜質1、2、3、4、5的峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.2倍（0.2%），其他單個未知雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積（0.2%）；各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的1.5倍（1.5%）。

1.3.6 方法的驗證

1.3.6.1 對照品貯備液的配制：取頭孢米諾對照品及各雜質對照品適量至不同量瓶中，精密稱定，分別制成100 μg/mL的溶液。

1.3.6.2 專屬性：取供試品適量，精密稱定，分別精密移取各雜質對照品貯備液至此量瓶中，用稀釋劑稀釋溶解制成含頭孢米諾鈉1 mg/mL，各雜質2 μg/mL的溶液。將此溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，測定所有色譜峰之間的分離度。

1.3.6.3 準確度:標準品溶液：精密量取各雜質對照品貯備液至同一量瓶中，稀釋制成各雜質2 μg/mL的溶液；未加標溶液：取供試品適量，精密稱定，溶解并稀釋制成含頭孢米諾鈉1 mg/mL的溶液；加標溶液：分別制備50%、100%、150%水平加標溶液：取供試品適量，精密稱定，分別精密移取各雜質對照品貯備液至此量瓶中，用稀釋劑稀釋溶解制成含頭孢米諾鈉1 mg/mL，各雜質1、2、3 μg/mL的溶液。分別將各溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各加標溶液的回收率及回收率的RSD%，回收率的范圍均應在90%～108%，RSD%應不大于3。

1.3.6.4 重復性:標準品溶液、未加標溶液、100%水平加標溶液的配制方式同1.3.6.3準確度項下。分別將各溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各加標溶液的回收率的RSD%，RSD%應不大于3。

1.3.6.5 定量限與檢測限：逐級稀釋各雜質對照品貯備液至同一量瓶中，注入色譜儀，記錄色譜圖。定量限混合溶液中，各物質的峰高的信噪比均應不小于10；檢測限混合溶液中，各物質的峰高的信噪比均應在3～10。

1.3.6.6 線性與范圍：精密移取各貯備液至同一量瓶中，分別稀釋制成含各物質6、4、3、2、1.6、1 μg/mL的溶液（線性級別分別為：300%、200%、150%、100%、80%、50%），分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到濃度下的各物質峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程，計算相關系數(shù)R值。

1.3.6.7 校正因子：將得到的1.3.6.6項下的各雜質標準曲線的斜率分別除以頭孢米諾標準曲線的斜率，即得到各雜質的校正因子。

1.3.6.8 耐用性：分別使用以下色譜條件進樣標準品溶液、未加標溶液、100%水平加標溶液：柱溫分別為25℃、35℃；流速分別為0.9、1.1 mL/min，檢測波長252、256 nm。各耐用性條件下各雜質含量按外標法計算，均應不大于2%。

1.3.6.9 樣品檢測：用建立并完成驗證的方法檢測6批供試品有關物質，計算各雜質含量。

2 結果

2.1 方法優(yōu)化結果

2.1.1 色譜柱篩選 使用色譜柱1、2，雜質4、5分離度均小于1，色譜圖中，兩峰未分開，使用色譜柱3，各雜質均能良好分離，最小分離度為1.3。圖略。

2.1.2 雜質穩(wěn)定性考察 各雜質峰峰面積的RSD結果如表2所示。雜質2峰面積的RSD%＞2。

表2 各雜質穩(wěn)定性結果（峰面積）Tab 2 Results of stability of the impurities（peak area）

2.1.3 稀釋劑的優(yōu)化 筆者嘗試不含乙酸的稀釋劑，即：水-甲醇-四氫呋喃（990∶5∶5）。各雜質峰峰面積的RSD結果如表3所示。各雜質峰面積的RSD%均＜2，本研究使用此稀釋劑。

表3 優(yōu)化稀釋劑后各雜質穩(wěn)定性結果（峰面積）Tab 3 Results of stability of the impurities after optimize the diluent（peak area）

2.2 方法的驗證

2.2.1 專屬性 所得色譜圖及各色譜峰之間的分離度結果如表4、圖1所示。所有峰之間的分離度均大于1.2，專屬性良好。

圖1 加標供試品溶液圖譜Fig 1 Chromatogram of spiked test solution

表4 專屬性溶液峰結果Tab 4 Peak results of specific solution

2.2.2 準確度 各加標溶液的回收率及RSD%如表5所示。所有雜質回收率均在90%～108%，回收率RSD%均小于3，均符合規(guī)定。

表5 各雜質回收率結果（%）Tab 5 Results of recovery for each impurity（%）

2.2.3 重復性 各100%加標溶液中，雜質1、2、3、4、5的回收率的RSD%分別為1.832、0.472、0.724、0.484、0.654，均小于3，符合規(guī)定。

2.2.4 定量限與檢測限 當各雜質峰高信噪比約為10時，頭孢米諾、雜質1、2、3、4、5濃度分別為0.103、0.123、0.016、0.129、0.081、0.060 μg/mL，即為方法的定量限；當各雜質峰高信噪比約為3時，頭孢米諾、雜質1、2、3、4、5濃度分別為0.041、0.049、0.007、0.052、0.033、0.024 μg/mL，即為方法的檢測限。

2.2.5 線性與范圍、校正因子 頭孢米諾及各雜質的線性及范圍結果為：頭孢米諾在0.10～6.20 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=9.523 2X-0.173 3，R2=1.000 0；雜質1在0.05～6.23 μg/mL線性關系良好，回歸方程為Y=3.479 6X-0.355 5，R2=0.999 1，校正因子為2.73；雜質2在0.01～6.82 μg/mL線性關系良好，回歸方程為Y=29.909 0X-0.858 1，R2=0.999 9，校正因子為0.32；雜質3在0.09～6.78 μg/mL線性關系良好，回歸方程為Y=9.068 7X-0.284 9，R2=0.999 9，校正因子為1.05；雜質4在0.05～6.13 μg/mL線性關系良好，回歸方程為Y=7.847 1X-0.141 3，R2=1.000 0，校正因子為1.21；雜質5在0.05～6.84 μg/mL線性關系良好，回歸方程為Y=8.286 1X-0.178 6，R2=0.999 9，校正因子為1.15。

2.2.6 耐用性 各耐用性條件下，均有雜質含量變化超過2%，更換條件均不能滿足耐用性要求。此方法應嚴格按照方法進行。各耐用性條件下各雜質含量變化如表6所示。

表6 耐用性結果（雜質含量，%）Tab 6 Results of durability（content of impurities，%）

2.2.7 樣品檢測6批樣品檢測結果如表7所示。其結果均滿足質量標準的要求。

表7 6批樣品有關物質檢測結果（%）Tab 7 Test results of 6 batches of sample（%）

3 討論

本研究建立了注射用頭孢米諾鈉中的有關物質的HPLC檢測方法，以《中國藥典》中頭孢米諾鈉項下的質量標準為基礎，根據(jù)各雜質的性質篩選了反相色譜柱及稀釋劑條件，其中篩選色譜柱使得各物質的分離度符合要求，篩選稀釋劑增加了雜質的穩(wěn)定性，使得方法驗證能順利進行。然后對此方法進行了方法驗證，驗證結果表明，該方法具有良好的專屬性、準確度、重復性、線性范圍，并計算出了各雜質的校正因子，方法需嚴格按照標準進行。最后檢測了6個批次的樣品，結果均符合質量標準的要求。綜上，本方法成功建立，能準確檢測本公司的樣品。