IL-18抑制劑對膿毒癥并發(fā)血小板減少小鼠的保護作用

李家富，許華，王勇強

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，天津市急救醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192）

血小板減少是重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）危重癥患者常見的并發(fā)癥[1-2]，與膿毒癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。膿毒癥并發(fā)血小板減少患者的死亡率高于非血小板減少患者，且血小板減少持續(xù)2周以上者的死亡率高達66%[5]。然而目前膿毒癥相關(guān)性血小板減少的分子機制尚不明確。研究顯示，白細胞介素（IL）-18與膿毒癥患者的死亡率呈正相關(guān)[6-7]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，IL-18與膿毒癥并發(fā)血小板減少具有相關(guān)性，膿毒癥患者IL-18表達水平與血小板減少程度呈負相關(guān)[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用脂多糖（LPS）單次腹腔注射法誘導(dǎo)膿毒癥并發(fā)血小板減少小鼠模型并添加IL-18抑制劑（IL-18Bp），觀察抑制IL-18對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠模型的保護作用。IL-6、IL-10、IL-18、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是與機體發(fā)展為膿毒癥密切相關(guān)的炎性標(biāo)志物[9-10]，監(jiān)測炎癥細胞因子水平可評估IL-18Bp對膿毒癥并發(fā)血小板減少小鼠的保護作用。本文旨在探討IL-18與膿毒癥并發(fā)血小板減少的關(guān)系，為膿毒癥并發(fā)血小板減少的分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級C57BL/6雄性小鼠30只，8周齡，體重18～21g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，合格證號：SYXK（津）2019-0002，飼養(yǎng)于室溫25℃，濕度45%~55%，每日光照8 h，自由飲水、進食1周。

1.2 主要試劑LPS（北京索萊寶科技有限公司），IL-18Bp（北京義翹神州科技股份有限公司），sCD40L檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司），IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α ELISA檢測試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 實驗分組、模型制備與給藥 將30只小鼠依次編號，按照隨機數(shù)字表法分為3組：對照組、LPS模型組（LPS組）、LPS加IL-18Bp干預(yù)組（LPS/IL-18Bp組），每組10只。其中LPS組和LPS/IL-18Bp組給予單次腹腔注射30 mg/kg LPS制備膿毒癥并發(fā)血小板減少模型[11]。對照組給予等體積生理鹽水，LPS/IL-18Bp組在LPS注射后給予單次腹腔注射50 μg/kg IL-18Bp[12]。

1.4 觀察各組72 h生存率 在LPS注射后觀察各組72 h生存/死亡情況。

1.5 采集血樣檢測各組血小板數(shù)量 在LPS注射后24 h，每組各取5只小鼠，摘眼球取血，其中取30 μL用EDTA抗凝后全血細胞分析儀檢測血小板數(shù)量，其余血樣制備富血小板血漿。

1.6 ELISA檢測各組富血小板血漿中sCD40L、IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α水平 取各組富血小板血漿，按ELISA試劑盒操作步驟對各組血漿中sCD40L、IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α的表達水平進行檢測。

1.7 HE染色觀察并分析各組脾臟的病理變化 收集各組造模24 h脾臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片，二甲苯及梯度酒精脫蠟水化后，蘇木素染色5 min，伊紅復(fù)染后封片，顯微鏡下200倍放大采集圖像，觀察脾臟組織的病理變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制小鼠生存曲線，采用Long-rank檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-18抑制劑對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠生存率的影響 對照組72 h存活率為100%，LPS組24 h、48 h和72 h存活率分別為85%、64%、52%，LPS/IL-18Bp組分別為98%、95%、77%，LPS/IL-18Bp組各時間點的生存率均顯著高于LPS組（χ2=0.63，P<0.05），見圖1。

圖1 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠生存率的影響Fig 1 The effect of IL-18Bp on the survival rate of LPS-induced TCP mice

2.2 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠外周血血小板數(shù)量的影響 在LPS注射24 h時，LPS組血小板數(shù)量顯著下降，而LPS/IL-18Bp組血小板數(shù)量較LPS組高（574.23×109/Lvs.267.10×109/L），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.37，P=0.001），見圖2。

圖2 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠血小板數(shù)量的影響Fig 2 The effect of IL-18Bp on the platelet counts of TCP mice induced by LPS

2.3 IL-18抑制劑對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠外周血血小板活化的影響 在LPS注射24 h時，LPS組血小板活化標(biāo)志物sCD40L的表達較對照組顯著升高，而LPS/IL-18Bp組血小板活化標(biāo)志物sCD40L較LPS組下降（3.74 ng/mLvs.9.18 ng/mL），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.33，P=0.001；t=4.34，P=0.012），見圖3。

圖3 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠血小板活化標(biāo)志物sCD40L表達的影響Fig 3 The effect of IL-18Bp on the expression of the platelet activation marker sCD40L of TCP mice induced by LPS

2.4 IL-18抑制劑對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α表達的影響 與對照組相比，LPS組炎癥因子IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α表達量均升高，但抑制IL-18后，LPS對IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α表達量的促進作用均明顯下降，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（與對照組相比，t=7.68、10.92、5.14、16.93，P=0.002、0.001、0.007、0.000；與LPS組相比，t=8.18、10.95、5.34、10.68，P=0.001、0.001、0.006、0.001），見圖4。

圖4 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠IL-18、TNF-α等炎癥因子表達的影響Fig 4 The effect of IL-18Bp on the expression of IL-18，TNF-α and other inflammatory cytokines in the TCP mice induced by LPS

2.5 IL-18抑制劑對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠脾臟組織的影響LPS組脾臟組織有炎癥細胞因子浸潤，對照組、LPS/IL-18Bp組未見明顯異常，見圖5。

圖5 IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)TCP小鼠脾臟組織的影響（200×）Fig 5 The effect of IL-18Bp on the spleen tissue of TCP mice induced by LPS（200×）

3 討論

膿毒癥是指宿主對感染產(chǎn)生的免疫失控反應(yīng)，進而發(fā)生器官功能障礙，是目前急危重癥患者死亡的主要原因，亦是全球醫(yī)療健康體系最主要的問題之一[13-15]。據(jù)統(tǒng)計，約66.7%的膿毒性休克患者會合并不同程度的血小板減少，并且約有5%~20%的患者進展為嚴(yán)重血小板減少[16-17]。ICU患者血小板減少30%是死亡的獨立危險因素，不依賴于疾病的嚴(yán)重程度或器官衰竭的數(shù)目，同危重病評分具有同等預(yù)測死亡率的價值[1]。然而目前關(guān)于血小板計數(shù)在膿毒癥患者中減少的機制尚不清楚。

IL-18是一種參與機體感染和炎癥起始免疫反應(yīng)的重要促炎細胞因子[18]。多項研究顯示，IL-18與膿毒癥具有相關(guān)性，并且前期臨床研究顯示，外周血IL-18的表達量與膿毒癥患者血小板減少程度呈負相關(guān)[8，19-20]。本研究制備了LPS誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型，并通過添加IL-18Bp干預(yù)，探討IL-18與膿毒癥并發(fā)血小板減少的關(guān)系。

本研究表明，小鼠單次腹腔注射LPS后血小板計數(shù)開始下降，且LPS組72 h生存率僅為52%，提示血小板減少模型構(gòu)建成功。本實驗還觀察到IL-18Bp的干預(yù)能夠顯著增加LPS誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型的72 h生存率，說明抑制IL-18對LPS誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型具有一定的保護作用。為進一步探究IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)小鼠血小板減少模型的具體保護作用，筆者對其血小板計數(shù)、血小板活化以及IL-18等炎癥因子和免疫器官脾臟的組織病理進行了檢測分析。

由于在前期研究中，筆者對30 mg/kg LPS單次腹腔注射誘導(dǎo)血小板減少小鼠模型血小板減少的發(fā)生率為96.7%，并對血小板計數(shù)進行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在LPS注射后2 h左右可發(fā)生血小板減少，24 h時血小板計數(shù)達到最低值，之后血小板計數(shù)會逐漸回升，故此次采用IL-18抑制劑干預(yù)LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠時，著重觀察了LPS注射后24 h時血小板計數(shù)等各項觀察指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，IL-18Bp不僅能夠緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠血小板計數(shù)的減少，而且能夠減少LPS刺激引發(fā)的血小板活化標(biāo)記物sCD40L的表達，提示IL-18Bp能夠在一定程度上減少LPS誘導(dǎo)的血小板活化。除此之外，筆者還觀察到在給予小鼠IL-18Bp干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠體內(nèi)IL-18表達量減少，同時IL-6、IL-10和TNF-α的表達量也較未使用IL-18Bp干預(yù)的LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠減少，同時脾臟病理分析結(jié)果顯示LPS刺激后的脾臟有明顯的炎癥因子浸潤，而IL-18Bp干預(yù)的小鼠脾臟未見明顯異常，這些觀察結(jié)果均提示IL-18Bp干預(yù)能夠在一定程度上抑制LPS刺激引發(fā)的小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，IL-18Bp對LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠具有一定的保護作用，能夠在一定程度上緩解LPS誘導(dǎo)血小板減少小鼠的血小板計數(shù)減少、血小板活化和炎癥反應(yīng)，但其具體的分子作用機制仍需進一步研究。