B族維生素對(duì)肌肉萎縮小鼠PMO運(yùn)輸效率的影響

宋軍，林曹瑞，賈璐璐，韓剛，尹海芳

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院臨床生物化學(xué)教研室，天津 300203）

杜興肌肉萎縮癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種伴X染色體隱性遺傳的致死性疾病，在新生男孩中發(fā)病率為1/3 500，是兒童最常見的肌肉萎縮癥[1]?；颊呒∪饧?xì)胞膜嚴(yán)重受損，最終因膈肌或心肌纖維化或壞死而過早死亡[2-4]。

糖皮質(zhì)激素是目前臨床上針對(duì)DMD治療使用最為廣泛的一種藥物，但由于該藥物不能從根本上恢復(fù)dystrophin蛋白的表達(dá)，因此治療效果十分有限[5-6]；并且該激素藥物普遍存在生長抑制等多種不良反應(yīng)，使DMD的治療仍具有重大挑戰(zhàn)[7]。Eteplirsen是一種磷酸二胺嗎啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligonuclcotides，PMO），也是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）最早批準(zhǔn)的用來治療DMD的藥物[8-9]。但eteplirseen在臨床使用時(shí)出現(xiàn)治療效果有限等問題，表明該治療方法還需要更多的研究來改進(jìn)和完善，因此尋找一種安全的小分子藥物能夠使PMO在較低劑量下，有效提高外顯子跳讀效率以及肌肉組織中dystrophin蛋白的表達(dá)，被認(rèn)為具有巨大的臨床價(jià)值。同時(shí)有報(bào)道稱，6-thioguanine[10]、Dantrolene[11]等一些化學(xué)藥物能夠提高DMD模型鼠PMO的跳讀效果，對(duì)PMO在DMD的治療中起到顯著的促進(jìn)作用；并且本課題組前期發(fā)現(xiàn)，己糖和氨基酸等一些營養(yǎng)物也能夠?qū)MD的外顯子跳讀療法有明顯的促進(jìn)作用[12-13]；而B族維生素作為人體內(nèi)正常生命活動(dòng)所必須的輔酶，是機(jī)體所必須的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。為探究其是否能夠作為輔劑來增強(qiáng)PMO的治療效果，筆者在DMD模型mdx小鼠開展篩選和系統(tǒng)測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 所有維生素藥物購自Sigma公司，O.C.T冷凍包埋劑購自Sakura公司，Bradford試劑購自上海生工公司，dystrophin抗體購自Abcam公司，伊紅和蘇木素染色試劑購自北京中杉金橋公司，山羊血清（NGS）和胎牛血清（FBS）購于Invitrogen公司，含DAPI熒光封片劑購自北京中杉金橋公司。SPF級(jí)C57BL/6小鼠購自北京維通利華公司[合格證號(hào)：1112511911004196；許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0005]；mdx小鼠自行繁殖于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及給藥 對(duì)于局部注射實(shí)驗(yàn)，27只同年齡的mdx小鼠通過簡單隨機(jī)抽樣分成9組：PMO生理鹽水組和PMO聯(lián)合8種維生素實(shí)驗(yàn)組，每組3只，2 μg的PMO添加到生理鹽水或其他維生素溶液（5%）中，制成40 μL體積的注射液，注射到各組mdx小鼠的脛骨前肌中，2周后收樣，Saline表示PMO生理鹽水組，其他為不同維生素與PMO混合治療的實(shí)驗(yàn)組。對(duì)于系統(tǒng)注射實(shí)驗(yàn)，6只同年齡的mdx小鼠通過簡單隨機(jī)抽樣分成兩組：PMO生理鹽水組和PMO聯(lián)合維生素B12組，每組3只，將PMO劑量改成25 mg/kg添加到生理鹽水和5% B12溶液中，制成120 μL體積的注射液通過尾靜脈進(jìn)行注射，每周1次，注射3次，最后1次注射后2周收樣。PMO-S組表示PMO生理鹽水組，PMO-B12表示PMO與維生素B12混合治療的實(shí)驗(yàn)組，C57表示野生型的陽性對(duì)照，mdx組表示不給藥的空白對(duì)照，且所有實(shí)驗(yàn)的C57和mdx小鼠都是年齡匹配的小鼠。

1.2.2 組織蛋白提取和濃度測(cè)定 動(dòng)物處死后取出肌肉組織，用O.C.T包埋放入液氮冰凍，用冷凍切片機(jī)切成組織碎片收集到EP管中，加入90 μL組織裂解液（95%lysis buffer+5%β-mercaptoethanol）在冰上裂解30 min，隨后13 000×g（r=40 cm）離心10 min，取上清即為蛋白樣品。蛋白濃度測(cè)定使用Bradford法進(jìn)行測(cè)定，取稀釋100倍的蛋白樣品和5個(gè)不同濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與250 μL的Bradford溶液混合，用酶標(biāo)儀測(cè)量各溶液在595 nm處的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出不同樣品的蛋白濃度。

1.2.3 Western印跡檢測(cè)特異性蛋白表達(dá)水平 配制濃度為6%的SDS-PAGE凝膠，實(shí)驗(yàn)組以及陰性對(duì)照mdx組的每個(gè)蛋白樣品取50 μg進(jìn)行上樣，陽性對(duì)照C57組根據(jù)標(biāo)注的百分比乘以50 μg進(jìn)行不同量的上樣（2% C57即上樣1 μg、5% C57即上樣2.5 μg、6%C57即上樣3 μg、8%C57即上樣4 μg、10% C57即上樣5 μg），80 V恒壓下電泳30 min后調(diào)至120 V恒壓電泳3 h，通過110 mA的恒流過夜將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，隨后用5%脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗孵育過夜，再用牛奶洗3次，每次10 min，立即用二抗進(jìn)行孵育，再用PBST洗3次，每次15 min，洗完后加上發(fā)光液（A液：B液=1:1），在暗室進(jìn)行壓片曝光。每個(gè)樣品中dystrophin蛋白表達(dá)水平通過Image J軟件得出灰度值與對(duì)照的百分比C57樣品灰度值進(jìn)行對(duì)比定量，計(jì)算出樣品中dystrophin蛋白的含量。

1.2.4 組織中dystrophin蛋白免疫熒光染色 選擇冷凍切片機(jī)切出厚度為8 μm的組織切片，放室溫平衡，隨后用油性筆圈出組織在玻片上的范圍，放入干凈的PBS中浸泡10 min，取出滴入封閉液（20% NGS、20%FBS和60%PBS）室溫封閉1.5 h，去除封閉液后滴加dystrophin一抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次后滴加含有DAPI的封片劑封片并避光晾干。

1.2.5 肌肉組織HE染色 選擇冷凍切片機(jī)切出的8 μm厚的組織切片，放室溫平衡，隨后放入干凈的PBS中浸泡10 min，取出進(jìn)行梯度水化（無水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇各浸泡5 min），浸入蒸餾水15 s，取出浸泡到蘇木素染液中13 min，用蒸餾水洗去玻片背景，浸入伊紅染液染色1 min，同樣用蒸餾水洗去背景后進(jìn)行梯度脫水（70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→無水乙醇分別15 s、30 s、1 min、3 min），隨后浸入二甲苯中通透5～10 min，最后用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Adobe photoshop、Adobe illustrator和Image J軟件對(duì)圖片和數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)通過±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色檢測(cè)B族維生素局部篩選情況 首先通過組織免疫熒光染色檢測(cè)肌肉組織中dystrophin陽性肌纖維的數(shù)量和分布情況，結(jié)果顯示：與PMO生理鹽水組相比，PMO與維生素B2、B3、D-Panthenol、B9和B12混合能顯著提高dystrophin陽性肌纖維的恢復(fù)數(shù)量（圖1A），其中維生素B12混合治療組dystrophin陽性肌纖維數(shù)量最多，達(dá)到了49.3%（t=8.015，P＜0.01，圖1B）。

圖1 免疫熒光染色檢測(cè)不同維生素與PMO在mdx小鼠上的局部篩選情況（100×）Fig 1 Local screen of vitamins with PMO in mdx mice by immunofluorescence（100×）

2.2 Western印跡檢測(cè)B族維生素局部篩選情況PMO與維生素B2、B3、D-Panthenol和B12混合能顯著提高dystrophin蛋白的表達(dá)水平（圖2A），通過計(jì)算各組灰度值與對(duì)應(yīng)的2% C57（1 μg）、5%C57（2.5 μg）、8% C57（4 μg）、10% C57（5 μg）灰度值對(duì)比定量，結(jié)果顯示，維生素B12混合治療組表達(dá)水平最高，達(dá)到了10.5%（t=5.207，P＜0.05，圖2B）。

圖2 Western印跡檢測(cè)不同維生素與PMO在mdx小鼠上的局部篩選情況Fig 2 Local screen of vitamins with PMO in mdx mice by Western blotting

2.3 免疫熒光染色檢測(cè)維生素B12對(duì)PMO系統(tǒng)的促進(jìn)作用 相比于PMO生理鹽水組B12治療組脛骨前肌和股四頭肌組織中dystrophin陽性肌纖維數(shù)量明顯增多（圖3）。

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療情況（100×）Fig 3 Systemic evaluation of vitamin B12 and PMO in mdx mice by immunofluorescence（100×）

2.4 Western印跡檢測(cè)維生素B12對(duì)PMO系統(tǒng)促進(jìn)作用 同樣選擇小鼠肌肉組織蛋白檢測(cè)dystrophin蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，B12治療后蛋白表達(dá)水平有所提高（圖4A），而通過計(jì)算各組灰度值與對(duì)應(yīng)的2% C57（1 μg）、5% C57（2.5 μg）、6% C57（3 μg）、10% C57（5 μg）灰度值對(duì)比定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輔助添加B12聯(lián)合治療后脛骨前?。╰=9.631，P＜0.01）和股四頭?。╰=8.452，P＜0.01）dystrophin蛋白表達(dá)水平得到了顯著的提高（圖4B）。

圖4 Western印跡檢測(cè)維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療情況Fig 4 Systemic evaluation of vitamin B12 and PMO in mdx mice by Western blotting

2.5 PMO-B12對(duì)mdx小鼠肌肉病理的影響PMOB12聯(lián)合治療組沒有出現(xiàn)肌肉的不良反應(yīng)（圖5）。

圖5 維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療病理檢測(cè)（100×）Fig 5 Muscle pathology of mdx mice treated with vitamin B12 and PMO systemically（100×）

3 討論

DMD是一種常見的遺傳性肌肉萎縮癥，患病兒童在少年時(shí)便開始發(fā)病，并隨著年齡增加，癥狀不斷加重，到青少年時(shí)便失去獨(dú)自行動(dòng)能力，最終由于膈肌或心肌病變導(dǎo)致呼吸衰竭或心臟功能受損而過早死亡，患者平均壽命只有21歲[1，15]。而本研究所使用的DMD模型小鼠mdx是其dystrophin基因外顯子23發(fā)生點(diǎn)突變，形成終止密碼子，使蛋白不能正常表達(dá)，與疾病的發(fā)病機(jī)制相同，因此這種模型小鼠在一定程度上很好的體現(xiàn)了DMD的一些病癥[16-17]。

近年來關(guān)于DMD的治療也取得了一定的進(jìn)展，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市了多款外顯子跳讀療法的反義寡核苷酸藥物[18-19]。盡管如此，但在臨床使用時(shí)發(fā)現(xiàn)核酸藥物存在著難以解決的如用藥量大、靶向性差及系統(tǒng)運(yùn)輸效率低等問題，前期的報(bào)道稱Dantrolene[11]、己糖GF[12，20]以及glycine等[13]小分子分別通過影響剪接頻率、能量供給以及組織新生角度去促進(jìn)反義寡核苷酸藥物引起的外顯子跳讀，都取得了較好的治療效果，但現(xiàn)有的這些小分子輔劑對(duì)DMD患者心臟功能的改善效果非常有限。因此筆者通過動(dòng)物模型對(duì)生活中常見的營養(yǎng)分子維生素進(jìn)行篩選。

本研究首先在局部篩選過程中使用PMO與不同維生素混合進(jìn)行治療，以單獨(dú)的PMO治療效果為基準(zhǔn)，評(píng)價(jià)維生素帶來的促進(jìn)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素B12能將dystrophin蛋白恢復(fù)水平從5%作用提高到接近12%，展現(xiàn)出了巨大的潛力。在隨后的系統(tǒng)治療中，維生素B12作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑單獨(dú)治療并不能顯示出對(duì)dystrophin蛋白的恢復(fù)，這與6-thiog uanine[10]和glycine等[13]小分子輔劑類似，因此在系統(tǒng)治療中未設(shè)置單獨(dú)維生素B12實(shí)驗(yàn)組，但通過與PMO生理鹽水組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)維生素B12聯(lián)合治療能夠顯著提高PMO在脛骨前肌和股四頭肌上的治療效果，但治療效果主要體現(xiàn)在占比較大的骨骼肌上面，推測(cè)維生素B12在通過尾靜脈注射進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，很快隨血流進(jìn)行全身系統(tǒng)的分布，但由于脂溶性較差很難在組織內(nèi)部進(jìn)行停留，快速被機(jī)體清除出去[21-22]。因此針對(duì)占比較大的骨骼肌更能受到維生素帶來的影響，這也導(dǎo)致PMO的治療效果在大多數(shù)的肌肉組織非常有限，因此后續(xù)改變維生素B12的給藥途徑，例如口服給藥或者給藥頻率改成每日補(bǔ)充，可能會(huì)顯著提高維生素B12的治療效果。同時(shí)通過HE染色檢測(cè)肌肉組織病理情況發(fā)現(xiàn)，維生素PMO-B12聯(lián)合治療在提高原有的PMO治療效果的同時(shí)，并未檢測(cè)到肌肉的損傷，推測(cè)是由于水溶性維生素不會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行蓄積，會(huì)被快速清除，因此避免了因?yàn)轭l繁給藥而帶來一定的不良反應(yīng)在后續(xù)研究中，將會(huì)在mdx小鼠上對(duì)PMO聯(lián)合維生素B12進(jìn)行一個(gè)長期的系統(tǒng)治療，進(jìn)一步探究維生素B12對(duì)PMO治療的促進(jìn)作用，為DMD的臨床治療提供新的治療手段。