基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)酸棗仁生物堿抗抑郁作用機(jī)制的研究

孫丹晨，王志慧，喬衛(wèi)

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，天津 300070）

抑郁癥是一種以情緒低落、自我價(jià)值感降低、快感缺失為主要癥狀的精神類疾病[1]，多伴有失眠癥狀，嚴(yán)重時(shí)有自殘或自殺傾向，已成為嚴(yán)重威脅人類身心健康的世界性疾病。目前對(duì)抑郁癥的治療主要以西藥為主，但是西藥存在不良反應(yīng)多、耐藥性及過敏性等問題，所以對(duì)相關(guān)中藥的研究日益迫切。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，是臨床治療失眠癥、抑郁癥、焦慮癥的常用中藥[2]，含有皂苷、黃酮、脂肪酸、生物堿等化學(xué)成分[3]。有研究表明，酸棗仁生物堿具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁的作用[4]。酸棗仁生物堿所含化學(xué)成分類型多樣，且通過多目標(biāo)、多渠道、多層次綜合調(diào)控發(fā)揮藥效[5]。因此復(fù)雜的靶點(diǎn)和機(jī)制是研究的難點(diǎn)。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究和開發(fā)領(lǐng)域，為研究中醫(yī)藥與靶點(diǎn)疾病的關(guān)系提供了新的契機(jī)[6]。故本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選酸棗仁生物堿治療抑郁癥的有效成分，并且對(duì)成分發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)與信號(hào)通路進(jìn)行整合與分析，初步闡明其抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；TCMDatabase@Taiwan（http://tcm.cmu.edu.tw/）；Pubmed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Pharm Mapper Server（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）；UniProtDatabase（http：//www.uniprot.org/）；Drug Bank Database（http：//www.drugbank.ca/，Version 4.3）；DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；美國化學(xué)文摘數(shù)據(jù)庫（Chemical Abstract Service，CAS）；Chem Bio Draw Ultra 12.0；Cytoscape3.4.0。

1.2 酸棗仁生物堿主要成分收集 通過檢索TCMSP、TCMDatabase@Taiwan、Pubmed、CAS等數(shù)據(jù)庫收集酸棗仁生物堿成分。

1.3 主要成分抗抑郁潛在作用靶點(diǎn)的反向預(yù)測(cè)及篩選 根據(jù)已知18個(gè)酸棗仁生物堿成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，利用Chem Bio Draw Ultra 12.0軟件畫出化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以（*sdf）格式保存，將文件上傳Pharm Mapper Server，靶點(diǎn)蛋白種類選擇為Human Protein Targets，每個(gè)中藥成分將得到300個(gè)潛在抗抑郁的作用靶點(diǎn)[7]。然后在UniProt數(shù)據(jù)庫中篩選作用靶點(diǎn)物種為人，并將名稱校正為官方名稱[8]，可以獲得該靶點(diǎn)的基因、功效等相關(guān)信息。在Drug Bank數(shù)據(jù)庫中檢索目標(biāo)靶點(diǎn)，并與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的小分子抗抑郁藥靶點(diǎn)對(duì)比。應(yīng)用Cytoscape3.4.0篩選各靶點(diǎn)的Degree大于8的靶蛋白，用于生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.4 抗抑郁靶點(diǎn)KEGG及GO分析 將Pharm Map－per Server中返回的與抑郁相關(guān)的潛在靶點(diǎn)上傳到DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。KEGG整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息，靶點(diǎn)蛋白直接反映到靶點(diǎn)通路上，藥物靶向富集途徑一般被認(rèn)為是藥物調(diào)節(jié)的途徑和藥物發(fā)揮療效的機(jī)制。通過GO富集分析，獲得靶標(biāo)的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）富集項(xiàng)，并預(yù)測(cè)靶標(biāo)的功能分布。

1.5 生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建Cytoscape3.4.0是一款開放源碼的圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的生物咨詢軟件，可將基因表達(dá)信息、靶點(diǎn)通路疾病相關(guān)功能注釋整合進(jìn)網(wǎng)絡(luò)中，觀察彼此之間的關(guān)聯(lián)性[9]。每個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node）分別代表成分、靶點(diǎn)、通路，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接即為邊（Edge）代表各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。通過綜合衡量3個(gè)指標(biāo)即網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（Degree）、中介中心性（Node betweenness）、接近中心性（Closeness）去評(píng)估網(wǎng)絡(luò)圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的顯著性。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度、中介中心性、接近中心性值越大，揭示其在網(wǎng)絡(luò)中的顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 酸棗仁生物堿主要成分 通過檢索化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)收集并篩選酸棗仁生物堿成分，最終獲得18個(gè)成分。具體化學(xué)信息如表1所示。

表1 酸棗仁生物堿成分的化學(xué)信息Tab 1 Chemical information of alkaloid constituents of ZSS

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 主要成分抗抑郁潛在作用靶點(diǎn) 將Pharm Mapper Server返回的作用靶點(diǎn)與Drug Bank中FDA批準(zhǔn)的小分子抗抑郁藥物靶點(diǎn)比對(duì)分析，篩選出15個(gè)抗抑郁相關(guān)潛在靶點(diǎn)（見表2）以及10個(gè)相關(guān)具有抗抑郁作用的活性生物堿成分（N-甲基巴婆堿、酸李堿、木蘭花堿、荷葉堿、異紫堇定堿、原荷葉堿、烏藥堿、觀音蓮明堿、鵝掌楸葉堿、酸棗仁環(huán)肽）。

表2 酸棗仁生物堿成分抗抑郁潛在靶點(diǎn)信息Tab 2 Information on potential antidepressant targets of alkaloid constituents in ZSS

2.3 潛在抗抑郁靶點(diǎn)KEGG通路 酸棗仁生物堿成分治療抑郁癥的15個(gè)潛在靶點(diǎn)共涉及131條相關(guān)信號(hào)通路。表3及圖1列舉出頻率較高的8條相關(guān)信號(hào)通路。其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路是最主要的靶點(diǎn)通路。

表3 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點(diǎn)KEGG通路注釋分析結(jié)果Tab 3 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

圖1 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點(diǎn)KEGG通路注釋分析結(jié)果Fig 1 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.4 GO富集分析結(jié)果 對(duì)酸棗仁生物堿的15個(gè)潛在抗抑郁靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。分析結(jié)果可以用來研究靶標(biāo)的功能分布，靶標(biāo)的功能分布分別由3部分組成：生物過程、分子功能和細(xì)胞成分，如圖2所示。分析氣泡圖可知，15個(gè)潛在抑郁靶點(diǎn)涉及17種生物進(jìn)程，6個(gè)細(xì)胞組分以及13種分子功能（q<0.01，q<0.05，q<0.05）。RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、GTPase活性的正調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)是潛在靶點(diǎn)參與的主要生物過程。在分子功能分析中，蛋白連接和Ras鳥苷-核苷酸交換因子活性是非常重要的；等離子體膜與細(xì)胞核是潛在靶點(diǎn)涉及的主要細(xì)胞成分。

圖2 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點(diǎn)GO通路注釋分析結(jié)果Fig 2 GO annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.5 生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 如圖3所示，酸棗仁生物堿抗抑郁失眠的“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”生物網(wǎng)絡(luò)圖由156個(gè)節(jié)點(diǎn)（10個(gè)成分、15個(gè)靶點(diǎn)及131條信號(hào)通路）和259條邊構(gòu)成。不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表酸棗仁生物堿中抗抑郁失眠的活性成分、潛在靶點(diǎn)及調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用。節(jié)點(diǎn)的大小代表每個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（Degree），度中心性越高節(jié)點(diǎn)就越大，越能顯示出該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的重要性。分析網(wǎng)絡(luò)圖可知，酸棗仁生物堿成分荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿在“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度較高，可能是治療抑郁癥的重要成分；預(yù)測(cè)獲得的15個(gè)作用靶點(diǎn)中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶點(diǎn)基因可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥的主要靶點(diǎn)；PI3K-Akt信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥涉及的主要通路。

圖3 酸棗仁生物堿抗抑郁“成分-靶點(diǎn)-通路”生物網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Antidepressant'component-target-pathway'biological network diagram of alkaloids in ZSS

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以抑郁癥為目的疾病，篩選酸棗仁生物堿中具有抗抑郁的活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路。通過分析生物網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，酸棗仁生物堿中有10個(gè)成分可能具有抗抑郁效果，其中荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿等成分對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)個(gè)數(shù)較多，說明這些成分可能是酸棗仁生物堿發(fā)揮作用的重要成分，為確認(rèn)酸棗仁生物堿抗抑郁有效成分提供了理論依據(jù)。

預(yù)測(cè)獲得的15個(gè)作用靶點(diǎn)中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶點(diǎn)基因可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥的主要靶點(diǎn)。P0DP23是一種鈣調(diào)蛋白（CALM1）。鈣離子能在細(xì)胞內(nèi)傳遞神經(jīng)信號(hào)，廣泛參與機(jī)體各種生理功能的調(diào)節(jié)[10]。P00533稱為表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），是一種多功能跨膜糖蛋白，其配體可介導(dǎo)酪氨酸激酶活性。少量表皮生長(zhǎng)因子（EGF）可使細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)密切相關(guān)。有研究表明，正常生理功能哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中EGF和EGFR的表達(dá)很低，但在CNS損傷后第7天，EGF和EGFR的表達(dá)顯著增加，28 d后逐漸下降到正常水平[11]。據(jù)報(bào)道，磷酸化的EGFR和MAPK信號(hào)通路與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有協(xié)同作用[12]。P49841稱為糖原合酶激酶-3β（GSK3B），是磷酸化后完全失活的激酶之一[13]。近年來越來越多的研究表明，GSK3B在抑郁癥的發(fā)病和治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。例如：與正常人相比，在重度抑郁癥死亡患者大腦皮質(zhì)中GSK3B的活性顯著升高[14]；持續(xù)刺激GSK3B（KI小鼠），氟西汀的促神經(jīng)元再生及抗抑郁作用都會(huì)被消除[15]；選擇性抑制GSK3B可導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生抗抑郁作用等。P19793稱為視黃酸受體（RXR-α），視黃酸通過視黃酸受體影響下丘腦促皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）神經(jīng)元的活性、控制CRF的表達(dá)，導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的功能異常，進(jìn)而推測(cè)視黃酸信號(hào)系統(tǒng)對(duì)下丘腦CRF神經(jīng)元的調(diào)節(jié)可能是抑郁癥發(fā)病的一種新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在給予成年大鼠少量的RXR-α選擇性拮抗劑，可以縮短其在強(qiáng)迫游泳行為學(xué)檢測(cè)中的不動(dòng)時(shí)間，提示視黃酸可能通過RXR-α干預(yù)海馬神經(jīng)元活性和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等，從而控制下丘腦CRF的表達(dá)和HPA軸活性，進(jìn)而參與抑郁發(fā)病過程[16]。

研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路參與了微血管損傷和血管生成，在抑郁癥的發(fā)生中扮演重要角色[17]。有研究顯示氟西汀可以使海馬的Akt1表達(dá)增加，促進(jìn)Akt磷酸化，從而加速血管的生成，促進(jìn)海馬血液循環(huán)，都有助于抑郁癥的治療[18]。鈣離子信號(hào)通路與抑郁癥關(guān)系密切，是治療抑郁的重要機(jī)制之一。其作為一種鈣受體蛋白，廣泛存在于腦組織神經(jīng)元中，在神經(jīng)元的應(yīng)激和修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用。氟西汀和SNRIS可以激活大鼠前額葉皮質(zhì)中的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ（CaMKⅣ）。而CaMKⅣ抑制劑可在體外阻斷cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化[19]。

本研究最終預(yù)測(cè)獲得酸棗仁生物堿抗抑郁的生物網(wǎng)絡(luò)圖，從整體角度分析酸棗仁總生物堿的抗抑郁成分、主要靶點(diǎn)和通路。綜上所述，酸棗仁生物堿中抗抑郁成分荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿主要通過影響神經(jīng)信號(hào)傳遞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、HPA軸活性、PI3K-Akt通路活化以及MAPK反應(yīng)級(jí)聯(lián)等發(fā)揮抗抑郁作用，本研究為下一步抗抑郁活性成分分離及活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。