絲素蛋白抗菌性修飾在皮膚組織工程中的應(yīng)用

崔雅婷，馬保金，葛少華

機(jī)械創(chuàng)傷、燒傷或慢性炎癥等損害造成的皮膚缺損可導(dǎo)致皮膚組織直接暴露于環(huán)境中，使其易受到細(xì)菌的侵襲，因此在治療時控制感染對于提高治療修復(fù)效率具有重要的意義。自體皮膚移植雖是臨床上治療皮膚缺損的有效方法，但存在供體皮膚不足、二次創(chuàng)傷等問題；而異體皮膚移植往往存在免疫排斥反應(yīng)等問題。皮膚組織工程為皮膚修復(fù)再生提供了新思路，其中支架材料在皮膚的再生中起著關(guān)鍵作用。支架材料可分為天然生物材料、人工合成材料和復(fù)合材料[1]。在眾多的天然生物支架材料中，絲素蛋白(silk fibroin，SF)是最受關(guān)注和歡迎的。優(yōu)良的生物相容性、出色的機(jī)械性能、可降解性、無毒無刺激性等優(yōu)勢使SF被廣泛應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面的修復(fù)中[2]。然而，SF本身不具備抗菌性能，在修復(fù)過程中傷口容易感染，導(dǎo)致修復(fù)效率較低甚至失敗。因此，通過修飾賦予SF抗菌性能，對于促進(jìn)SF在皮膚組織工程中的應(yīng)用具有重要意義。

1 SF的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

1.1 SF的結(jié)構(gòu)

SF是蠶絲通過脫膠提取得到的天然高分子纖維蛋白，其含量約占蠶絲的70%～80%。SF由一條重鏈(H鏈)和一條輕鏈(L鏈)組成，雙鏈通過二硫鍵連接在一起組成重鏈輕鏈H-L復(fù)合體[3]。SF主要晶體結(jié)構(gòu)是silk Ⅰ和silk Ⅱ。silk Ⅰ是具有曲柄或S形結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)；silk Ⅱ是反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，相鄰鏈段之間的氫鍵極大地增強(qiáng)了SF的剛度和拉伸強(qiáng)度[3-5]。甲醇處理后，silk Ⅰ可以轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk Ⅱ的β-折疊結(jié)構(gòu)[6]。

1.2 SF的理化性質(zhì)

蠶絲通過脫膠去除具有免疫原性的絲膠蛋白后，保留的SF顯示出優(yōu)良的生物相容性。SF來源于生物體，具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)，在非桑蠶(例如柞蠶絲)SF中具有的Arg-Gly-Asp(RGD)結(jié)構(gòu)還能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖[7]。有研究發(fā)現(xiàn)加入SF的支架材料具有更優(yōu)的孔隙率以及規(guī)則連續(xù)的結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的粘附和生長[8]。此外，SF可激活經(jīng)典的NF-κB信號通路來促進(jìn)傷口愈合[9]，同時還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移并合成膠原蛋白[10-11]。

SF還具有良好的機(jī)械性能，使其滿足創(chuàng)面修復(fù)的需求。SF的拉伸強(qiáng)度可達(dá)610～690 MPa，韌性達(dá)70～78 MJ/m3，相較于其他材料，SF具有很好的強(qiáng)度和韌性，并且在剛度方面優(yōu)于常用的聚合物材料(如膠原蛋白和聚乳酸)[12]。SF具備的高拉伸強(qiáng)度使其能夠適應(yīng)傷口愈合過程中的收縮以及周圍皮膚在日常運(yùn)動中的牽拉，在保持材料的機(jī)械完整性上，發(fā)揮創(chuàng)面的保護(hù)作用。

SF具有可降解性，但其降解吸收周期較長，降解速率與silk Ⅱ晶體結(jié)構(gòu)的含量、親水作用以及特殊的晶體-非晶體交替納米結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。理想的生物支架材料應(yīng)具有與組織修復(fù)相匹配的降解速率，通過對SF降解速率的調(diào)控，可以制備出更加適合于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的傷口敷料，同時SF的降解產(chǎn)物與人體皮膚具有較強(qiáng)的親和力，易于吸收，有助于對皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。

2 SF的抗菌性修飾

通過不同的抗菌性修飾，SF可以有效抗菌，提高皮膚組織的修復(fù)效率。目前修飾SF的抗菌劑主要分為無機(jī)抗菌劑、有機(jī)抗菌劑以及其他類型抗菌劑。

2.1 無機(jī)抗菌劑

修飾SF的無機(jī)抗菌劑主要包括金屬(如Ag、Zn、Ti等)及其氧化物(如TiO2、ZnO等)。無機(jī)抗菌劑主要通過釋放金屬離子以及產(chǎn)生高水平活性氧(reactive oxygen species，ROS)來發(fā)揮抗菌作用[14]。

近年來納米銀(Ag nanoparticles，AgNPs)抗菌劑受到廣泛關(guān)注。具有還原性的SF能夠原位還原硝酸銀生成AgNPs[15]，這種原位綠色還原方式可減少額外材料的加入，提高合成材料的生物相容性，同時生成的AgNPs能有效抑制大腸桿菌的生長。Zhang等[16]通過給蠶幼蟲喂食由葡萄糖包被的AgNPs，可獲得具有抗菌性能的蠶絲，研究結(jié)果顯示，低濃度0.02%和中等濃度0.20%AgNPs喂養(yǎng)幼蟲所產(chǎn)生的絲纖維不但具有抗菌特性，而且其伸長率和拉伸強(qiáng)度顯著增加，這為未來直接獲得具備抗菌性能的SF提供了新方向。Ag具有強(qiáng)效、廣譜抗菌性，且不易產(chǎn)生耐藥性，但其具有的細(xì)胞毒性不容忽視[17-18]。目前，有研究利用外泌體修飾AgNPs，通過形成蛋白質(zhì)保護(hù)降低AgNPs對細(xì)胞的毒性作用[19]。

有學(xué)者采用靜電紡絲技術(shù)將不同濃度的ZnO摻入透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)-SF納米纖維中，制備出具有核-殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米纖維，隨ZnO濃度的增加，納米纖維的抗菌活性顯著增強(qiáng)[20]。此外，通過冷凍干燥法制備出負(fù)載納米二氧化鈦(TiO2nanoparticles，TiO2NPs)的SF抗菌敷料，對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌性，其中敷料對白色念珠菌的抑菌能力最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的最弱，這可能是由于與革蘭陰性菌相比，革蘭陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖較厚，阻止了TiO2NPs的滲透[21]。

2.2 有機(jī)抗菌劑

有機(jī)抗菌劑主要是通過化學(xué)基團(tuán)與菌體胞膜相互作用有效抗菌。根據(jù)來源不同，有機(jī)抗菌劑可分為天然有機(jī)抗菌劑和人工合成有機(jī)抗菌劑。

2.2.1 天然有機(jī)抗菌劑 天然有機(jī)抗菌劑具有高生物相容性，在應(yīng)用過程中安全性更高。與SF結(jié)合的天然有機(jī)抗菌劑主要有殼聚糖(chitosan，CTS或CS)、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、溶菌酶(lysozyme，LY)等。

CS是一種帶正電荷的天然堿性多糖，在酸性環(huán)境中，氨基通過質(zhì)子化使CS成為陽離子多糖，其帶有的正電荷能夠與微生物細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互作用，通過改變微生物細(xì)胞膜的通透性殺死微生物[22]。CS與SF的結(jié)合多是采用冷凍干燥[23]、靜電紡絲[24]和層層自組裝(layer-by-layer self-assembly，LBL)等技術(shù)[25]，但CS的抗菌作用受其去乙?；潭?、分子量以及環(huán)境pH大小等影響[26]。納米CS具有高表面反應(yīng)、低毒性、小尺寸等特點(diǎn)，可改善CS的性能，通過冷凍干燥法與SF混合后既能夠發(fā)揮抗菌作用，同時又能提升支架材料的力學(xué)性能[27]。羧甲基殼聚糖具有抗菌性、水溶性以及多個功能性化學(xué)基團(tuán)，通過化學(xué)鍵、強(qiáng)氫鍵及聚合物構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與SF穩(wěn)定地結(jié)合，可用于老化蠶絲的修復(fù)并起到抗真菌的作用[28]。

AMPs是一類來源于生物體的帶正電荷的多肽物質(zhì)，其通過靜電作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，破壞胞膜的完整性[29]，產(chǎn)生抗菌活性。通過靜電紡絲技術(shù)將幽門螺桿菌核糖體蛋白A2(一種源自幽門螺桿菌的AMP)與SF相結(jié)合，得到一種具有高生物相容性和抗菌性的納米纖維。抑菌實驗結(jié)果顯示，復(fù)合納米纖維對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用[30]。目前，AMPs的基因工程研究可以改善AMPs來源不足、無法大規(guī)模生產(chǎn)的缺點(diǎn)[31]，并且采用酵母為基因工程受體菌的研究引起了人們的重視[32]，這可能作為進(jìn)一步研究AMPs修飾SF的切入點(diǎn)。

LY也是一種多肽物質(zhì)，其抗菌原理是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中的β-(1,4)-糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、細(xì)菌溶解[33]。將LY和膠原蛋白通過LBL技術(shù)交替沉積在SF和尼龍6復(fù)合納米纖維墊上后發(fā)現(xiàn)，復(fù)合納米纖維墊能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，但對革蘭陰性菌較不敏感[34]，可能因為革蘭陰性菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖，不易被LY破壞。

2.2.2 人工合成有機(jī)抗菌劑 與天然有機(jī)抗菌劑相比，人工合成有機(jī)抗菌劑最大的優(yōu)勢在于其性質(zhì)穩(wěn)定，能夠高效抗菌。SF人工合成有機(jī)抗菌劑的修飾主要包括聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、聚(六亞甲基雙胍)鹽酸鹽(poly(hexamethylenebiguanide)hydrochloride，PHMB)等。

PEI是一種聚陽離子聚合物，其具有進(jìn)入細(xì)胞或滲透細(xì)胞膜的能力，在生物醫(yī)學(xué)中作為藥物載體用于抗菌。通過靜電紡絲技術(shù)制備的PEI/SF傷口敷料具有良好的生物相容性以及抗菌性能[35]，但PEI對細(xì)胞的毒性會隨著分子量的增加、濃度的升高以及結(jié)構(gòu)的變化而增強(qiáng)的。針對細(xì)胞毒性問題，有研究者利用D-甘露糖修飾PEI，使修飾后的PEI在10 μg/mL的濃度時就顯示出良好的殺菌效果，并且在該濃度下沒有顯示出明顯的細(xì)胞毒性[36]。

PHMB是一種陽離子低聚物的高效抗菌劑，PHMB可與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜粘附，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中鉀離子和其他成分的外流，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性屏障完全喪失，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[37]。Liang等[38]通過靜電相互作用、氫鍵結(jié)合以及范德華力將帶正電荷的PHMB與帶負(fù)電荷的SF相結(jié)合，采用冷凍干燥技術(shù)制備出具有抗菌功能的多孔SF海綿。研究表明，PHMB/SF的抗菌作用隨PHMB含量的增加而增強(qiáng)，且對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用要優(yōu)于大腸桿菌。

2.3 其他抗菌性修飾

除以上抗菌劑的修飾外，通過改善SF形狀與結(jié)構(gòu)及應(yīng)用離子電滲療法也能賦予SF支架材料抗菌特性。

對皮膚施加直接恒定的低密度電流稱為離子電滲療法，Lemos等[39]開發(fā)出一種含有神經(jīng)緊張素的絲素膜，應(yīng)用離子電滲療法來抑制細(xì)菌的生長，結(jié)果顯示當(dāng)陽離子電滲療法應(yīng)用于革蘭陽性菌時會有抑菌圈的形成。Tullii等[40]采用軟刻蝕的方法實現(xiàn)了具有不同幾何形狀的微米和納米結(jié)構(gòu)的SF載體，研究顯示附著在經(jīng)該載體修飾后的SF材料表面上的細(xì)菌數(shù)量最多減少了66%，同時將經(jīng)微米和納米結(jié)構(gòu)修飾后的SF薄膜與半導(dǎo)體聚合物相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)防污性能也得到了很好的保留。

3 SF的抗菌性修飾在皮膚組織工程中的應(yīng)用

燒傷、割傷、擦傷等造成的大面積缺損使皮膚直接暴露于環(huán)境中，往往會伴隨著復(fù)雜感染，開發(fā)具有良好抗菌活性的傷口敷料極為重要。已有研究通過以SF作為支架材料同時添加抗菌劑，制備出具有抗菌性的傷口敷料用于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)。

將外泌體修飾的AgNPs添加到CTS-SF/硬脂酸(stearic acid，SA)中，制備成CTS-SF/SA/Ag-Exo敷料。體外實驗結(jié)果顯示，細(xì)菌通過分泌磷脂酶來溶解外泌體導(dǎo)致AgNPs釋放，AgNPs破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致微生物死亡。同時CTS-SF/SA/Ag-Exo敷料對多種致病菌均有很好的抑菌作用，在感染初期AgNPs的釋放能夠有效殺死細(xì)菌、控制炎癥，從而促進(jìn)傷口的愈合[19]。

通過LBL技術(shù)將聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)/SF膜與第四代甲殼素(quaternized chitin，QC)/SF沉積形成PQCSF傷口敷料，研究發(fā)現(xiàn)PQCSF的抗菌性隨沉積層的增加而增強(qiáng)，并且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長都有很好的抑制作用；另外QC的抗菌活性和SF促愈合的作用，可以協(xié)同加快傷口的愈合[41]。

Han等[42]制備的聚多巴胺納米顆粒(polydopamine nanoparticles，PDA NPs)貽貝型CS/SF冷凍凝膠，利用近紅外的光熱轉(zhuǎn)化協(xié)同CS的殺菌能力增強(qiáng)抗菌活性。PDA NPs通過吸收光能并轉(zhuǎn)化為熱能，使細(xì)菌中的酶和蛋白質(zhì)變性從而溶解細(xì)菌。研究顯示在皮膚損傷后第21天，通過近紅外光照射的PDA NPs-CS/SF組中剩余傷口面積最小。

與身體其他部位相比，口腔頜面部皮膚直接暴露在外，缺乏衣物或防護(hù)服的保護(hù)，在外力作用下尤其在戰(zhàn)爭中更易受到損傷。爆炸和火器造成的軟組織損傷在頜面部創(chuàng)傷中占有較高的比例，損傷創(chuàng)面易被細(xì)菌和塵土等污染，導(dǎo)致傷口感染，增加損傷的復(fù)雜性和嚴(yán)重性。因此，開發(fā)具有抗感染、促愈合的傷口敷料用于口腔頜面部創(chuàng)傷的修復(fù)具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，具有非對稱潤濕改性的CTS-SF Ag/SA海綿敷料在親水側(cè)能夠緩慢釋放敷料中的AgNPs顆粒，有效殺滅細(xì)菌，加速感染傷口的愈合；在疏水側(cè)能夠減少敷料內(nèi)部水分喪失，隔絕空氣中的微生物，防止創(chuàng)面的二次感染，從而有利于傷口的愈合[43]。此外，有研究通過靜電紡絲技術(shù)制備出SF基質(zhì)材料用于口腔黏膜創(chuàng)面的修復(fù)，實驗結(jié)果表明SF基質(zhì)具有較好的創(chuàng)面愈合能力，能夠改善創(chuàng)面疤痕組織的形成以及表皮的生長[44]。然而具有抗菌性修飾的SF對于口腔黏膜創(chuàng)面的修復(fù)未見報道?？谇粌?nèi)存在多種細(xì)菌，仍存在創(chuàng)面感染的風(fēng)險。因此，SF的抗菌性修飾對口腔黏膜創(chuàng)面的修復(fù)可能成為未來研究的新方向。

4 小 結(jié)

SF優(yōu)良的生物相容性、促愈合性、可降解性以及出色的機(jī)械性能，使其作為傷口敷料可以廣泛應(yīng)用于修復(fù)受損創(chuàng)面。通過進(jìn)行抗菌性修飾可以使SF有效地控制傷口感染。目前針對無機(jī)抗菌劑、人工合成有機(jī)抗菌劑的細(xì)胞毒性問題及天然有機(jī)抗菌劑的穩(wěn)定性、來源等問題已經(jīng)得到相應(yīng)的研究和改善，這為開發(fā)具有更安全、更高效抗菌性能的SF支架材料提供了新思路。在皮膚組織工程的應(yīng)用中，SF能夠協(xié)同促進(jìn)傷口的愈合，但相關(guān)研究局限于體外實驗和體內(nèi)動物模型，仍需進(jìn)一步的臨床試驗加以驗證。