鈦表面納米形貌及特性對成纖維細(xì)胞影響的研究進(jìn)展

劉玉潔，李保勝，張震陽，歐燕珍，孟維艷

天然牙中，冠根方向上齦溝底到牙槽嵴頂之間的恒定距離為3～4 mm，即軟組織的“生物學(xué)寬度”，包括近冠方約2 mm的結(jié)合上皮以及近根方的結(jié)締組織，而在種植體周圍也存在類似天然牙的生物學(xué)寬度。生物學(xué)寬度對于維持種植體周圍軟硬組織健康具有重要意義。為了維持生物學(xué)寬度，避免細(xì)菌滲透破壞種植體初期愈合或長期效果，早期軟組織細(xì)胞粘附和長期軟組織封閉屏障的維護(hù)至關(guān)重要，是組織整合的關(guān)鍵部分。

眾多表面處理技術(shù)中，納米技術(shù)作為當(dāng)下研究熱點有望對下一代醫(yī)療設(shè)備的設(shè)計、開發(fā)和制造產(chǎn)生重大影響。納米結(jié)構(gòu)表面對細(xì)胞行為的調(diào)控是近年來的研究熱點，其中模仿天然納米尺度的界面在生物材料研究領(lǐng)域引起了廣泛的興趣。由于細(xì)胞行為可以受可溶性因子、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相互作用的調(diào)控[1]，改善細(xì)胞及ECM作用的種植體納米級結(jié)構(gòu)可以影響細(xì)胞諸多特征，從形態(tài)到基因表達(dá)。

1 天然牙和種植體周圍的結(jié)締組織

天然牙周圍牙齦組織的生物封閉不僅依賴于上皮附著，還依賴于牙齦纖維將結(jié)締組織附著在牙根表面，尤其是齦牙纖維和Sharpey纖維。牙周膜中膠原纖維數(shù)量最多，主要有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅻ型膠原。其中Ⅰ型膠原成分最多，由上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共同分泌形成。直徑約70 nm的膠原纖維聚集成直徑幾微米的膠原束，以Sharpey纖維的形式垂直插入牙根表面的牙骨質(zhì)。牙齦纖維的垂直附著可以提供強大的粘附力，阻止上皮根方遷移，在維持上皮附著水平和牙齒懸吊中起著重要作用，從而抵抗牙周牙齦組織炎癥和機械應(yīng)力。

早期研究認(rèn)為種植體周圍纖維走行平行于種植體表面，但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)種植體周圍的纖維可以向不同方向延伸，甚至垂直伸入種植體多孔表面[1-3]。垂直于種植體表面的纖維走行可以增加結(jié)締組織的粘附性，抵抗結(jié)締組織/種植體界面的機械性撕裂。通過電泳融合的方法將Ⅰ型膠原垂直插入直徑約67 nm的二氧化鈦納米管中，作為結(jié)締組織初期結(jié)合位點，可以明顯抑制上皮的伸展及上皮層的形成[4]，說明了垂直了種植體表面的纖維可以阻止上皮細(xì)胞根方遷移。另外，種植體周圍有許多Ⅴ型膠原纖維，對膠原酶具有抵抗性，因此種植體周圍的結(jié)締組織通常呈慢性炎癥狀態(tài)，而不是攔截或防御狀態(tài)[5]。

結(jié)締組織中成纖維細(xì)胞通過黏著斑粘附在種植體表面上，黏著斑蛋白表達(dá)增加與成纖維細(xì)胞粘附強度的提高相關(guān)，通過改變種植體表面微納米形貌調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的粘附性及形態(tài)，對于抵御種植體周炎具有重要意義。

2 種植體表面特性對軟組織整合的影響

Albrektsson和Wennerberg將種植體表面特性分為三類：機械性能、形貌性能和理化性能。他們指出：這些特性是互相影響的，改變其中任意一個特性，其他特性也會隨之改變[6]。為了促進(jìn)種植體/軟組織界面結(jié)合的強度和穩(wěn)定性，提高短期和長期預(yù)后效果，本文重點關(guān)注表面形貌及理化性能中濕潤性對結(jié)締組織的影響。

2.1 表面形貌與粗糙度

有研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞表現(xiàn)在納米級或者微米級結(jié)構(gòu)的表面上無明顯差異[7]。但是相比于單一的微米形貌而言，在微米級結(jié)構(gòu)材料上賦予納米級結(jié)構(gòu)可以明顯促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的功能，包括粘附性、增殖性以及Ⅰ型膠原的合成[8]，這表明納米級結(jié)構(gòu)的存在對成纖維細(xì)胞具有重要意義。

不同于上皮細(xì)胞的是成纖維細(xì)胞在輕微粗糙表面的表現(xiàn)似乎更好。光滑的鈦種植體表面會被纖維包膜所包繞，使得組織幾乎與種植體表面相分離，但是納米管有良好的組織整合性，可以明顯促進(jìn)細(xì)胞和組織的粘附力，甚至減少炎癥因子的釋放[9]。研究對比鈦納米管管徑方面，認(rèn)為管徑范圍在70～90 nm有利于人牙齦成纖維細(xì)胞的粘附和增殖反應(yīng)[10-11]。但是，動物體內(nèi)實驗認(rèn)為直徑100 nm的鈦納米管和機械處理的光滑表面軟組織附著表現(xiàn)相似，纖維走行依舊平行于種植體表面[12]，在管徑為40 nm的納米管上培養(yǎng)人表皮成纖維細(xì)胞也未見細(xì)胞粘附性有明顯提高[13]。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)100 nm管徑的納米管比20、200 nm管徑納米管更適合人牙齦成纖維細(xì)胞的粘附、增殖和Ⅰ型膠原分泌[14]。在酸蝕20 min和60 min的表面上分別形成粗糙度為0.1～0.15 μm和0.5～0.7 μm的凹坑及突起結(jié)構(gòu)，成纖維細(xì)胞接種培養(yǎng)3 d后未見兩組間有增殖、Ⅰ型膠原合成的差異[15]，不同處理方法雖然可以形成不同粗糙度的表面，但是這種差別對細(xì)胞行為似乎不具有意義。

材料表面凹槽走行可以調(diào)控細(xì)胞取向，在機械加工獲得的平均粗糙度為(0.104±0.010)μm、凹槽寬度為100～200 nm的鈦表面上，雖然成纖維細(xì)胞增殖活力沒有改變，但是納米凹槽走形能有效地驅(qū)動早期(48 h)牙齦成纖維細(xì)胞的取向，促進(jìn)細(xì)胞的粘附性[16-17]。值得注意的是制備不同納米形貌表面修飾可能是在鈦表面上創(chuàng)建類似于天然牙Sharpey纖維狀結(jié)構(gòu)的解決方案之一。在堿熱法形成的納米孔隙直徑約200 nm的表面上，Kato等見到了成纖維細(xì)胞外基質(zhì)伸入到亞微米級突起、孔隙及溝槽之間，兔體內(nèi)實驗驗證了種植體周圍纖維垂直走行類似于牙周膜[4]，對人皮膚成纖維細(xì)胞的研究中，這種納米級孔隙和突起可以促進(jìn)ECM的合成，在ECM和材料表面之間建立充分的機械整合，以抵抗機械、酶和化學(xué)剝離處理，且不引起促炎反應(yīng)[18]，證實了表面形貌改善種植體周圍軟組織封閉的可能性。

另外，植體周圍的成纖維細(xì)胞會發(fā)生纖維化，其中細(xì)胞粘附性、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加是細(xì)胞纖維化的標(biāo)志，有研究發(fā)現(xiàn)相比于光滑鈦片，噴砂酸蝕處理后的粗糙鈦片表面上人牙齦成纖維細(xì)胞中α-SMA和纖連蛋白含量更低、粘附面積和粘附強度均較低，胞外基質(zhì)重組相關(guān)基因上調(diào)，認(rèn)為特定鈦片表面形貌可以抑制人牙齦成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化，對于減少瘢痕組織的形成具有意義[19]。

雖然粗糙度似乎對細(xì)胞行為無明顯影響，但是表面形貌確實會對細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。有研究通過制備具有微米級溝槽和納米級孔的分層微納米復(fù)合形貌，將其與光滑表面和不規(guī)則微米尺度的表面進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)整合素在復(fù)合微納米表面上的表達(dá)要高于另外兩個表面，且證實了整合素α2-PI3K-AKT信號軸在分層微納米形貌促進(jìn)細(xì)胞粘附和成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。而在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，適當(dāng)?shù)谋砻嫘蚊部梢允笻3K27快速去甲基化，使成骨相關(guān)基因啟動子區(qū)域的H3K4me3水平升高[21]。這些都驗證了形貌對細(xì)胞命運的重要影響，但表面形貌在成纖維細(xì)胞中的作用機制的研究仍不充足。

2.2 濕潤性及表面自由能

潤濕性被認(rèn)為是種植體重要的表面特性。通常使用液體-固體接觸角(contact angle，CA)來量化濕潤性，CA是三相邊界處液滴表面的切線與液體一側(cè)水平固體表面之間的角度。通常表面水接觸角小于90°被認(rèn)為屬于親水性，表面水接觸角大于90°被認(rèn)為是疏水的。但濕潤性除了與材料極性基團賦予的內(nèi)在性質(zhì)——親水性、疏水性有關(guān)外，還與物體表面性狀如孔隙有關(guān)，只有當(dāng)固體表面完全光滑平整時，材料表面對水的濕潤性才完全取決于物體內(nèi)在的親疏水性，所以平時看到的接觸角更多反應(yīng)的是材料對水濕潤性的高低[22]。

受表面化學(xué)以及表面形貌影響的表面潤濕性和相關(guān)的表面能對于優(yōu)化材料周圍生物活性至關(guān)重要。增加濕潤性可以增強種植體表面與生物環(huán)境之間的相互作用。表面潤濕性不僅影響蛋白質(zhì)的吸附，對細(xì)胞的粘附和遷移也有重要作用，在設(shè)計植入物時，表面能具有選擇性抑制細(xì)菌粘附，同時提高細(xì)胞活性的作用。70 nm的陽極氧化納米管相比于光滑表面的濕潤性更好，在粗糙的納米形貌基礎(chǔ)上進(jìn)行親水性處理可以更加明顯地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，利于血管生成因子激活從而促進(jìn)種植體周圍新生血管的形成[23]。通過對微米表面進(jìn)行改性獲得微/納米復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以提高材料表面親水性[24]。增加表面納米粗糙度可以增加潤濕性，從而增加表面能，但是原子層沉積的二氧化鈦納米涂層表面的發(fā)現(xiàn)與常規(guī)認(rèn)識有所不同，成纖維細(xì)胞的粘附力與初始表面能是成反比的[25]。這種不確定性可能與表面吸附蛋白動力學(xué)與種植體其他理化特性之間的復(fù)雜作用相關(guān)。但是可以確定的是表面粗糙度/表面自由能較高的種植體表面會促進(jìn)菌斑生物膜的形成[26]，高粗糙度和高表面能對于種植體的生物特性是一把雙刃劍，如何合理利用這把雙刃劍是值得探討的。

3 結(jié)論與展望

納米形貌修飾是當(dāng)前鈦表面設(shè)計的一個重要研究熱點，現(xiàn)階段對經(jīng)皮膚或者穿黏膜的醫(yī)療材料研究結(jié)果匯總后認(rèn)為，納米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能是促進(jìn)軟組織封閉的關(guān)鍵步驟。眾所周知，細(xì)胞微環(huán)境中，基因和胞外介質(zhì)共同調(diào)控細(xì)胞行為及功能，不同表面形貌會導(dǎo)致基因表達(dá)的差異[27]，例如在干細(xì)胞方面，表面形貌促進(jìn)組蛋白第三亞基的乙?；絹碛绊懠?xì)胞的功能和表觀遺傳特性，平行微槽所產(chǎn)生的各向異性可以誘導(dǎo)細(xì)胞對齊[28]。由于表觀遺傳調(diào)控機制非常復(fù)雜，且實驗技術(shù)上的限制，全面揭示表觀遺傳機制仍是一大難題，所以后續(xù)種植體材料表面形貌對周圍軟組織細(xì)胞表觀遺傳表達(dá)模式的深層機制仍有待深究。現(xiàn)階段對于種植體/軟組織界面的研究以體外實驗為主，而體內(nèi)環(huán)境錯綜復(fù)雜，尤其體外實驗無法模擬種植體周圍纖維走行，體內(nèi)實驗應(yīng)成為軟組織探究過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié)，種植體周圍結(jié)締組織的體內(nèi)實驗有待繼續(xù)完善。