獨活寄生湯高效液相色譜指紋圖譜的建立和7種有效成分含量的測定

吳洪杰 林蕾 滕莉

摘要 目的：建立高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜法分析獨活寄生湯中7種有效成分的方法，為臨床獨活寄生湯中藥處方的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。方法：分析獨活寄生湯中藥處方現(xiàn)代藥理研究文獻，篩選HPLC檢測主要有效成分，建立HPLC檢測上述有效成分的色譜條件，考察精密度、重復性、加樣回收率，檢測5批次獨活寄生湯煎液中獨參湯中蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0含量。HPLC檢測獨活寄生湯中主要有效成分的色譜條件為：ODSC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱;1 mL/min;柱溫為30 ℃，進樣量10 μL，檢測方法：設(shè)置監(jiān)測波長0～40 min采用330 nm檢測，41～80 min采用230 nm檢測;流動相：乙腈-0.08%甲酸（A），水-2.5%異丙醇-0.08%甲酸（B）洗脫程序：0～25 min，10%～26%流動相A，26～30 min，27%～44%流動相A，31～35 min，45%～46%流動相A，41～45 min，47%～48%流動相A;46～65 min，49%～92%流動相A;66～80 min，93%～100%流動相A。結(jié)果：蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0具有較好的線性關(guān)系，精密度（日內(nèi)和日間）RSD值均低于2.5%，7種成分檢測重復性RSD值均低于3.5%，7種成分的加樣回收率均≥95.0%。5批次獨活寄生湯中7種成分含量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：獨活寄生湯主要有效成分可通過HPLC進行定量分析，但不同種含量差異較大，可能與煎藥人不同、中藥材批次不同有關(guān)。

關(guān)鍵詞 獨活寄生湯;高效液相色譜指紋圖譜法;芍藥苷;蛇床子素;二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷;β-蛻皮甾酮;人參皂苷R0;方法學研究

Establishment of HPLC Fingerprint and Determination of 7 Components in Duhuo Jisheng Decoction

WU Hongjie， LIN Lei， TENG Li

（Pharmacy Department， Yantaishan Hospital of Yantai， Shandong Province， Yantai 264000， China）

Abstract Objective：To establish a HPLC fingerprint method for the analysis of 7 effective components in Duhuo Jisheng decoction， so as to provide reference for the quality control of Chinese medicinal prescription in Duhuo Jisheng Decoction. Methods：The modern pharmacological research literature of Duhuo Jisheng Decoction was analyzed， the main effective components were screened by HPLC， the chromatographic conditions were established for the determination of the above effective components by HPLC， and the precision， repeatability and sample recovery were investigated. The osthol， dihydrocarvacrol-β-D glucoside， dihydrocarvacrol， paeoniflorin and pinoresinol， β-ecdysterone， ginsenoside R0 in 5 batches of Duhuo Jisheng Decoction were detected. The chromatographic conditions for the determination of the main active ingredients in Duhuojisheng Decoction by HPLC were：odsc18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μ m）; 1 mL/min; column temperature was 30 ℃， injection volume was 10 μ L; detection method：the detection wavelength was set at 330 nm for 0～40 min and 230 nm for 41～80 min; mobile phase：acetonitrile-0.08% formic acid （a）， water-2.5% isopropanol-0.08% formic acid （B） Sequence：0～25 min， 10%～26% mobile phase A， 26～30 min， 27%～44% mobile phase A， 31～35 min， 45%～46% mobile phase A， 41～45 min， 47%～48% mobile phase A; 46～65 min， 49%～92% mobile phase A （2）. For 66 to 80 min， 93% to 100% mobile phase A. Results：There was a good linear relationship between osthol， dihydrocarinol-β-D glucoside， dihydrocarinol， paeoniflorin， rosinol diglucoside， β-ecdysterone and ginsenoside R0. The RSDS of precision （intra-day and inter-day） were all lower than 2.5%， and the repeatability RSDS of the 7 components were all lower than 3.5%. The recoveries of 7 components were all ≥95.0%. There were statistically significant differences in the content of 7 ingredients in weight of 5 batches of Duhuo Jisheng Decoction （P<0.05）. Conclusion：the main effective components of Duhuo Jisheng Decoction can be quantitatively analyzed by HPLC， but the contents of different kinds of drugs are quite different， which may be related to different decocting people and different batches of Chinese medicinal.

Keywords Duhuojisheng Decoction; HPLC fingerprint; Paeoniflorin; Osthol; Dihydrocresol-β-D glucoside; β-ecdysterone; Ginsenoside R0; Methodological study

中圖分類號：R289.4;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.013

獨活寄生湯始見于《備急千金要方》，對其功效描述為：“治腰背痛，獨活寄生湯。夫腰背痛者，皆猶腎氣虛弱，臥冷濕地當風所得也，不時速治，喜流入腳膝，為偏枯冷痹緩弱疼重，或腰痛攣腳重痹，宜急服此方?！盵1-3]經(jīng)后世醫(yī)家完善方劑及用法，以治療腎氣虛弱、肝脾不足而致的關(guān)節(jié)病為主。《醫(yī)方考》《靈樞經(jīng)》中均有獨活寄生湯治療關(guān)節(jié)病的病機及治則描述[4]。本研究擬建立獨活寄生湯高效液相色譜指紋圖譜質(zhì)量控制方法，以期為臨床獨活寄生湯古方新用等臨床研究工作提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀采用安捷倫公司生產(chǎn)的型號為1290 Infinity LC的高效液相色譜儀及其配高的經(jīng)驗泵、檢測器、自動進樣泵、柱溫箱。常規(guī)試驗儀器如電子分析天平、水浴鍋、冰箱、蒸發(fā)儀等為本院實驗室儀器設(shè)備。色譜柱為ODS公司生產(chǎn)的C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱。

1.2 試劑 色譜級乙腈、甲醇購自德國Merck公司，AR級甲酸、異丙醇購自四川鴻鶴化工試劑有限公司。所用水為醫(yī)院儀器分析實驗室自制新鮮重蒸餾水。

1.3 分析樣品 從中國生物制品檢定所購買蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0對照品。本研究所用中藥材均為本醫(yī)院中藥房提供，湯劑均由本院制劑室煎制。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜（HPLC） 檢測獨活寄生湯種有效成分色譜條件篩選：HPLC檢測獨活寄生湯中主要有效成分的色譜條件為：ODSC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱;1 mL/min;柱溫為30 ℃，進樣量10 μL，檢測方法：設(shè)置監(jiān)測波長0～40 min采用330 nm檢測，41～80 min采用230 nm檢測;流動相：乙腈-0.08%甲酸（A），水-2.5%異丙醇-0.08%甲酸（B）洗脫程序：0～25 min，10%～26%流動相A，26～30 min，27%～44%流動相A，31～35 min，45%～46%流動相A，41～45 min，47%～48%流動相A;46～65 min，49%～92%流動相A;66～80 min，93%～100%流動相A。

2.2 對照品溶液配制 采用十萬級電子天平精密稱取蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0對照品于25 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水約20 mL，手動振搖后置于常溫的超聲振蕩器中震蕩溶解10 min，取出再補加蒸餾水至25 mL刻度，具塞搖勻即為對照品溶液。分別取6份對照品母液，制作不同濃度水平的對照組液。對照溶液于4 ℃冰箱中保存，用前取出搖勻。

2.3 供試品溶液制備 按照獨活寄生湯的處方配齊中藥材，粉碎過篩，干燥。精密稱取混勻粉末0.5 g于索氏提取器中，加入25 mL蒸餾水，于水浴鍋上加熱至沸騰，回流提取120 min，經(jīng)快速濾紙過濾，用蒸餾水多次少量洗滌濾渣，補水至25 mL，混勻，離心得上層清液，再采用微孔濾膜過濾得供試品溶液。按照7種有效成分的色譜條件檢測，進樣量10 μL，檢測時間80 min。

2.4 專屬性試驗 對制備的5批樣品溶液進行檢測，主成分間、主成分與雜質(zhì)之間分離度均大于1.0，說明該色譜條件檢測獨活寄生湯專屬性強。

2.5 線性關(guān)系考察 取蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0對照品溶液，采用流動相（A∶B=1∶1）分別稀釋成1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍溶液搖勻，制成對照品系列濃度溶液，分別進樣10 μL，按照確定的色譜條件進行分離檢測。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制各對照品的回歸方程。各成分檢測限及回歸方程見表1。

2.6 日間精密度試驗 分別對7種對照溶液進行日內(nèi)精密度測試：同一日內(nèi)，同一個瓶對照品溶液，每間隔4 h進樣檢測1次，連續(xù)進樣6次，對6次檢測結(jié)果計算均值、標準差，計算6次樣品檢測結(jié)果的標準偏差值（RSD）。7種有效成分的精密度（日內(nèi)和日間）RSD值均低于2.5%。見表2。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 連續(xù)3 d在同一個時間段，分別取上述對照品溶液每日檢測2次，HPLC按照檢查前基線平衡，檢測結(jié)束后走基線至平穩(wěn)的方式操作。對照品溶液存放于4 ℃冰箱保存，用時取出。計算6次檢測結(jié)果均值，計算日間RSD值。計算6次檢測結(jié)果均值，計算日間RSD值。7種有效成分的精密度（日內(nèi)和日間）RSD值均低于2.5%。見表3。

2.8 重復性試驗 取獨活寄生湯處方中藥材，按照處方中劑量分別稱取6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液共6份，分別進樣檢測，計算7種有效成分的含量均值及相對標準偏差，7種成分檢測重復性RSD值均低于3.5%。見表4。

2.9 回收率試驗 取1分獨活寄生湯中藥材，向藥材中加入與處方中各成分濃度相近的對照品溶液，按照2.3項下方法制備供試品溶液，進樣檢測，計算7種有效成分的加樣回收率，7種成分的加樣回收率均≥95.0%。見表5。

2.10 樣品測定結(jié)果 由醫(yī)院藥房按照獨活寄生湯處方：獨活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、細辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃各6 g，為1劑，加水300 mL煮沸后文火微沸煎湯至200 mL，密封裝袋，連續(xù)煎5劑，于當天檢測，參照2.3項下的稀釋方法配制成供試品溶液，進樣檢測7種有效成分的含量，7種成分含量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表6。

3 討論

獨活寄生湯是臨床治療痹癥的經(jīng)典處方[5]，全方以辛溫之品獨活、桑寄生、細辛、防風、秦艽、桂枝為君，主升舉肝脾之氣，治腰膝酸痛;輔以養(yǎng)陰活血之品熟地黃、當歸、白芍、川芎、杜仲、牛膝等，助滋補肝腎之陰，行血理氣之功;再予以益氣之品人參、茯苓、甘草達養(yǎng)諸臟之陽祛冷痹之力[6-7]。隨著醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已有藥廠在獨活寄生湯處方上生產(chǎn)了獨活寄生合劑、獨活寄生顆粒劑等，采用獨活寄生湯治療慢性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕性坐骨神經(jīng)痛、腰肌勞損、骨質(zhì)增生癥、小兒麻痹等屬風寒濕痹日久，正氣不足等[8-9]。臨床研究顯示[10-11]，其作用獨特，應(yīng)用范圍廣。目前臨床應(yīng)用的獨活寄生顆粒劑和合劑在有效成分的控制方面，以芍藥苷為主。現(xiàn)代中藥藥理研究顯示，獨活發(fā)揮治療療效的有效成分以蛇床子素、二氫歐山芹醇-β-D葡萄糖苷、二氫歐山芹醇為主，杜仲的有效成分以松脂醇二葡萄糖苷為主，牛膝發(fā)揮治療作用的有效成分以β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0為主[12-13]。通過分析上述7種成分的化學性質(zhì)及極性，具備采用高效液相色譜指紋圖譜法制定定量控制質(zhì)量標準的條件。

高效液相色譜指紋圖譜作為控制中藥材、中成藥的重要手段[14]，其不僅可以通過高效液相色譜圖的圖像相似率情況對處方中的藥材進行定性鑒別，還可通過分離檢測有效成分的含量對其進行質(zhì)量狀況進行評價[15-16]。本研究采用高效液相色譜指紋圖譜對獨活寄生湯中7種有效成分進行檢測，結(jié)果顯示，所確定的色譜條件可對7種有效成分實行有效分離和檢測，方法學各項指標均符合高效液相色譜檢測的標準范圍[17-18]。但對5個批次的獨活寄生湯煎液進行7種成分檢測，每個批次成分含量差異均較大。說明煎藥方法對藥效成分的影響較大。這提示對于臨床廣泛應(yīng)用的經(jīng)典中藥組方，應(yīng)考慮制成穩(wěn)定的劑型，以穩(wěn)定質(zhì)量，確保療效[19]。

綜上所述，獨活寄生湯主要很有效成分可通過高效液相色譜法進行定量分析，但不同種含量差異較大，可能與煎藥人不同、中藥材批次不同有關(guān)，臨床應(yīng)加強對獨活寄生湯中藥材的篩選及對煎藥方法進行規(guī)范，提高湯藥的質(zhì)量穩(wěn)定性。

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（2020-04-01收稿 責任編輯：張雄杰）

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃立項項目（Y2016HW038）

作者簡介：吳洪杰（1980.11—），女，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥學，E-mail：wanxiayu@yeah.net