國標高效液相色譜法測定糕點中 脫氫乙酸含量方法優(yōu)化

◎ 郝 果，安曉娟，王琳帆

（富平縣檢驗檢測中心，陜西 富平 711700）

脫氫乙酸及其鈉鹽作為食品添加劑，是繼苯甲酸鈉、尼泊金、山梨酸鉀之后新一代的低毒高效的防腐劑，對霉菌和酵母菌的抑菌能力強，為苯甲酸鈉的2～10倍，高劑量時能有效抑制細菌繁殖。脫氫乙酸及其鈉鹽被人體各個組織吸收后分散于血漿和眾多器官中，抑制體內(nèi)多種氧化酶發(fā)揮作用。長期大量食用脫氫乙酸及其鈉鹽超標的食品，會對人體健康產(chǎn)生一定影響[1-2]。

目前常用的防腐劑主要有：山梨酸、苯甲酸和丙酸及其鹽類；沒食子酸、沒食子酸酯、對羥基苯甲酸酯類、棕櫚酸酯、抗壞血酸；亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽；乳鏈球菌和為他霉素；茶多酚、殼聚糖等。脫氫乙酸及其鈉鹽作為一種新型防腐劑具有突出的優(yōu)點，可耐光、耐熱，且在食品加工過程中不分解或蒸發(fā)，不產(chǎn)生異味，近年普遍受到廣大食品企業(yè)的歡迎[3]。脫氫乙酸及其鈉鹽對霉菌、酵母菌、細菌具有良好的抑制作用，其機制是通過抑制微生物的呼吸，可有效滲透到細胞體內(nèi)，以起到防腐、防霉、保鮮等作用，抑制有效濃度為0.5～1.0 g·kg-1，一般用量為 0.3～0.5 g·kg-1。主要用于黃油、腌漬蔬菜、發(fā)酵豆制品、淀粉制品、面包、糕點、焙烤食品、肉制品、復合調(diào)味品和果蔬汁，糕點中最大用量為0.5 g·kg-1[4]。食品中脫氫乙酸的測定方法有很多，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]等，其中高效液相色譜法因普及率高、準確性好而被廣泛應用。

《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》處理復雜耗時。本研究參照GB 5009.121—2016，主要采用高效液相色譜-紫外檢測器，用硫酸鋅溶液沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，再用正己烷除去脂類及糖類等物質(zhì)，最后離心過濾，減少了雜質(zhì)峰的干擾，同時確定了檢測器條件，建立了一種準確、快速、靈敏度高的糕點類食品中脫氫乙酸含量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）、CPA224S電子分析天平（德國賽多利斯儀器有限公司）、KQ-700VDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HC-3018離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

脫氫乙酸標準物質(zhì)（純度99.0%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，150 A，美國安捷倫科技有限公司）；氫氧化鈉、乙酸鋅（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；正己烷（色譜純，美國sigma公司）；水為實驗室自制超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

流 動 相：甲 醇：0.02 mol·L-1，乙 酸 銨 水 溶 液（10∶90，V∶V）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.2.2 樣品前處理

糕點：精確稱取樣品2 g，放入25 mL離心管中，加10 mL水，5 mL 120 g·L-1的硫酸鋅溶液，用20 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5后轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，用水定容，搖勻。將混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，超聲10 min，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加10 mL正己烷，振搖1 min后靜置，待分層后棄去有機層，再加10 mL 正己烷重復提取1次，將下層水相置于離心管中， 4 000 r·min-1條件下離心10 min。最后取上清液過 0.45 μm有機濾膜，進高效液相色譜儀測定。

1.2.3 標準溶液配制

（1）標準儲備液（1.0 mg·mL-1的脫氫乙酸標準儲備液）配制。準確稱取0.100 0 g脫氫乙酸標準品于100 mL容量瓶中，用10 mL 20 g·L-1氫氧化鈉溶液溶解，用水定容至刻度線。4 ℃下有效期為3個月。

（2）脫氫乙酸標準工作液配制。分別吸取脫氫乙酸貯備液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10 mL、15 mL、20 mL置于100 mL容量瓶中后用水定容至刻度線，配制成濃度分別為1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1的系列標準工作液，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 標準工作曲線繪制

線性是指在一定的濃度范圍內(nèi)，測得的響應值與被測物質(zhì)濃度成比例關(guān)系的程度。以系列標準品的濃度和對應的峰面積分別為橫、縱坐標作圖，觀察是否呈線性。

本實驗用脫氫乙酸標準儲備液精密配制以下標準系列濃度：1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、 80.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1、150.0 μg·mL-1、 200.0 μg·mL-1，進樣量為10 μL，以脫氫乙酸濃度為橫坐標、以對應的峰面積為縱坐標制作標準回歸曲線，即Y=kX+b。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線、線性范圍

線性結(jié)果如圖1所示，該方法的濃度范圍為1.00～200.0 μg·mL-1，線 性 方 程 為Y=28.783 89X-22.820 36，相關(guān)系數(shù)r=0.999 84，線性關(guān)系良好。

圖1 脫氫乙酸的相關(guān)系數(shù)和回歸方程圖

2.2 檢出限及定量限

以標準曲線斜率法確定檢出限，采用樣品空白測定10次，平均值加上3倍標準偏差計算出檢出限。以標準曲線斜率法確定定量限，采用樣品空白值，加上10倍標準偏差計算出定量限。

脫氫乙酸標準品的液相色譜圖如圖2所示，按檢出限和定量限的驗證方法，當稱樣量為2.0 g時，計算得出檢出限為0.6 mg·kg-1，定量限為2 mg·kg-1，與 GB 5009.121—2016中方法檢出限（2 mg·kg-1）和定量限（5 mg·kg-1）相比，該方法有較高的靈敏度。

圖2 脫氫乙酸標準品色譜圖

2.3 樣品的測定

按照本研究方法對不同樣品進行前處理后用高效液相色譜儀進行測定，結(jié)果見表1。由測定結(jié)果可以看出在3種不同糕點中均檢出脫氫乙酸，且精密度為1.1%～2.6%，RSD均小于標準規(guī)定的10%。

表1 樣品中的脫氫乙酸含量的測定表

2.4 精密度

本研究采用相對標準偏差來評價實驗的精密度，精密度越小，說明平行性越好。將濃度為200.0 μg·mL-1的脫氫乙酸標準溶液重復測定7次，分別計算其出峰時間、峰面積以及濃度的相對標準偏差，以此來評價精密度和重復性。

將200.0 μg·mL-1的脫氫乙酸標準品溶液，重復測定7次，分別計算，其保留時間、峰面積和RSD為0.02%、0.20%和0.20%，精密度良好，其結(jié)果見表2。精密度越小，準確度越高，數(shù)據(jù)越可靠。

表2 精密度實驗結(jié)果表

2.5 加標回收實驗

本研究采用樣品加標回收，即在有被測物質(zhì)的樣品中加入定量的待測標準物質(zhì)，按照樣品的處理方法進行處理、測定、分析，得到的測定值減去本底值后與理論加標值的比值則為加標回收率。

精密稱取9份2 g樣品置于25 mL離心管中，分成3組，每組3份平行樣品，加入低、中、高3種不同濃度的脫氫乙酸標準溶液，按照樣品處理方法進行處理、測定、分析。根據(jù)加標回收率公式計算得出其平均回收率。測定結(jié)果見表3。從表3中可知其回收率的平均值98.3%，范圍為96.4%～101.0%，均在80%～120%范圍內(nèi)，回收率較高，說明本方法對糕點中脫氫乙酸含量的測定能起較好的質(zhì)控目的。

表3 糕點中脫氫乙酸的回收率表

2.6 檢測器的選擇

《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》中有2種檢測方法，一種是氣相色譜法，一種是液相色譜法。液相色譜法可用紫外檢測器和二極管陣列檢測器，但二極管陣列檢測器對溫度非常敏感，易導致基線不穩(wěn)定，靈敏度降低，脫氫乙酸在紫外檢測器和二極管陣列檢測器均有響應，但其在紫外檢測器上的響應值較大且靈敏度高，故選擇紫外檢測器。

3 結(jié)論

經(jīng)過優(yōu)化選擇高效液相色譜條件：色譜柱為C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相為甲醇： 0.02 mol·L-1，乙酸銨（10∶90，V∶V）；流速為 1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長293 nm。樣品經(jīng)硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，正己烷除去油脂和糖類，C18柱分離后，對糕點類樣品中脫氫乙酸含量進行測定。通過測定線性范圍、檢出限、定量限、精密度以及加標回收實驗，均得到了滿意結(jié)果。本方法檢出限為 0.6 mg·kg-1，定量限為2 mg·kg-1，優(yōu)于國標方法，說明本檢測方法靈敏度高、準確性好，能很好的測定糕點中脫氫乙酸的含量。