響應(yīng)面法優(yōu)化柚子酵素的發(fā)酵工藝

◎ 劉媛潔

（江西醫(yī)學高等?？茖W校，江西 上饒 334000）

柚子（Citrus grandis）是蕓香科柑橘屬柚樹果的果實[1]，在中國主要分布于福建、江西等南方地區(qū)[2-3]。柚子含有黃酮類、酚類、多糖類、有機酸、維生素類和微量礦物元素類等多種有益成分[4-6]。柚子果皮和果肉中均含有柚皮苷、橙皮苷、柚皮素等黃酮類化合物，其中柚皮苷含量最高[7-8]。柚子屬于藥食兩用水果，性溫，味清香、酸甜，具有理氣化痰、散寒燥濕、預(yù)防動脈硬化、降血脂、抗氧化等生理和藥用功能，且無明顯毒副作用[9-11]。

酵素是常以可食性的菌類、果蔬類、植物源類等為原料，經(jīng)有益菌發(fā)酵獲得的含有一定生物活性成分的有益食品，其中富含多種生物酶、維生素、氨基酸、酚類、黃酮類、多糖和益生菌等功能成分[12-14]。研究表明酵素中含有的功能成分物質(zhì)具有滅菌消炎、抗氧化、提高機體免疫能力、修復(fù)機體損傷等保健功能[15-18]。

目前，隨著現(xiàn)代人們對食品營養(yǎng)的多樣性、平衡性、功能性等需求的增加，酵素食品在國內(nèi)開始風靡，逐漸成為消費者的新寵[19]。柚子皮含有苦味成分柚皮苷[20]，導致全果綜合利用度不佳[21]。目前，柚子相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與研究主要集中在柚子皮果脯、柚子去皮后制備而成的果酒、飲料等[22-24]，將柚子全果加工成食用酵素的相關(guān)研究還未見報道。本文以廣豐馬家柚為試驗原料，選取酵母菌和乳酸菌為菌種進行發(fā)酵，以酵素中總黃酮含量為主要指標，研究了一種新型柚子酵素的發(fā)酵工藝，獲得了適口性好、功能性強的柚子酵素飲品，為柚子的綜合利用及工業(yè)生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚子（馬家柚），產(chǎn)自江西廣豐；紅糖，廣西農(nóng)墾糖業(yè)集團有限公司；酵母菌、乳酸菌，安琪酵母股份有限公司；蘆丁標準品，北京振翔科技有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱，深圳市澳德瑪電子科技有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器材廠；722S型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；冷凍離心機，美國Sigma公司；pH計，濟南光耀醫(yī)療設(shè)備有限公司；分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

稱取一定量的柚子全果，清洗后將柚子皮和柚子果肉切成4 cm3的小塊?？刂萍t糖添加量為50%，將部分紅糖放入發(fā)酵罐的底部，再將處理好的柚子皮和果肉塊放入其中，最后用剩下的紅糖覆蓋原料。酵母菌（活菌數(shù)為1×106CFU·mL-1）∶乳桿菌（活菌數(shù)為1×107CFU·mL-1）為2∶3（體積比）混合制備混合 菌種，在接種量為2%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下密閉發(fā)酵84 d。柚子發(fā)酵液經(jīng)濾布初過濾和板塊過濾后為柚子酵素原液。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

（1）菌種體積比。按照50%的紅糖添加量進行物料的投放，設(shè)定接種比例（酵母菌∶乳桿菌）依次為1∶3、2∶3、1∶1、3∶2和3∶1，接種量為2%，在發(fā)酵溫度為30 ℃條件下，恒溫密閉發(fā)酵84 d。發(fā)酵結(jié)束后以柚子酵素中總黃酮的含量為指標確定最佳接種比例。

（2）接種量。在上述優(yōu)化菌種體積比的基礎(chǔ)上，設(shè)定混合菌種的接種量依次為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，在紅糖添加量為50%和發(fā)酵溫度為 30 ℃條件下，恒溫密閉發(fā)酵84 d。發(fā)酵結(jié)束后以柚子酵素中總黃酮的含量為指標確定最佳接種量。

（3）紅糖添加量。在上述優(yōu)化的菌種體積比和菌種接種量的基礎(chǔ)上，設(shè)定紅糖添加量依次為30%、40%、50%、60%和70%，在發(fā)酵溫度為30 ℃條件下，恒溫密閉發(fā)酵84 d。發(fā)酵結(jié)束后以柚子酵素中總黃酮的含量為指標確定最佳紅糖添加量。

（4）發(fā)酵溫度。在上述優(yōu)化的菌種體積比、菌種接種量和紅糖添加量的基礎(chǔ)上，設(shè)定發(fā)酵溫度依次為24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃，恒溫密閉發(fā)酵84 d。發(fā)酵結(jié)束后以柚子酵素中總黃酮的含量為指標確定最佳發(fā)酵溫度。

（5）發(fā)酵時間。在上述優(yōu)化的菌種體積比、菌種接種量、紅糖添加量和發(fā)酵溫度的基礎(chǔ)上，設(shè)定發(fā)酵時間依次為4 d、12 d、20 d、28 d、36 d、44 d、52 d、60 d、68 d、76 d和84d。發(fā)酵結(jié)束后以柚子酵素中總黃酮的含量為指標確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.3 Box-Behnken試驗

自變量因素為紅糖添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D），響應(yīng)值指標為柚子酵素中的總黃酮含量（mg·mL-1），進行Box-Behnken試驗。試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設(shè)計表

1.2.4 蘆丁標準曲線的繪制

參考趙國超等[25]、鄭麗等[26]的方法，稍加修改。蘆丁標準樣品精確稱取20 mg于容量瓶中，80%乙醇定容至10 mL，獲得蘆丁標準溶液（2.0 mg·mL-1）。將不同量的蘆丁標準溶液（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）分別置于具塞管中，加入 0.7 mL的5% NaNO2溶液和3.0 mL的80%乙醇； 10 min后加入0.5 mL的14% Al(NO3)3溶液；10 min后加入3.0 mL的4% NaOH溶液；80%乙醇定容至 10.0 mL。在510 nm波長處測定吸光度，獲得良好線性關(guān)系的回歸方程（y=0.806 1x+0.023 5，R2=0.999 6）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗重復(fù)3次后結(jié)果取平均值。利用Excel軟件繪制單因素試驗結(jié)果圖；Design-Expert7.0軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 菌種體積比對柚子酵素中總黃酮含量的影響

由圖1可知，當酵母菌比例相對較小時，隨著酵母菌比例的逐漸增加，總黃酮含量呈現(xiàn)先增加后略降低的趨勢。當酵母菌和乳桿菌的菌種體積比為3∶2時，柚子酵素中總黃酮含量達到最大為1.96 mg·mL-1。當菌種體積比超過3∶2后對柚子酵素中總黃酮含量的影響不大。

圖1 菌種體積比對柚子酵素中總黃酮含量的影響圖

2.1.2 接種量對柚子酵素中總黃酮含量的影響

由圖2可知，柚子酵素中總黃酮含量隨著菌種接種量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當接種量達到2%時，柚子酵素中總黃酮含量達到最高值為 2.19 mg·mL-1。因此，選擇1.5%～2.5%范圍內(nèi)的接種量進行下一步試驗。

圖2 接種量對柚子酵素中總黃酮含量的影響圖

2.1.3 紅糖添加量對柚子酵素中總黃酮含量的影響

由圖3可知，柚子酵素中總黃酮的含量隨著紅糖的添加量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在40%～60%范圍內(nèi)的紅糖添加量對柚子酵素中總黃酮含量的影響較顯著，因此選擇該范圍內(nèi)的紅糖的添加量進行下一步的優(yōu)化試驗。

圖3 紅糖的添加量對柚子酵素中總黃酮含量的影響圖

2.1.4 發(fā)酵溫度對柚子酵素中總黃酮含量的影響

由圖4可知，柚子酵素中總黃酮的含量隨著發(fā)酵溫度的增加而呈現(xiàn)先增加而后逐漸降低的趨勢。當發(fā)酵溫度在30 ℃時，柚子酵素中的總黃酮含量達到最高值。當發(fā)酵溫度在28～32 ℃范圍內(nèi)對柚子酵素中的總黃酮含量影響較顯著，因此選擇該范圍內(nèi)的發(fā)酵溫度進行下一步的優(yōu)化試驗。

圖4 發(fā)酵溫度對柚子酵素中總黃酮含量的影響圖

2.1.5 發(fā)酵時間對柚子酵素中總黃酮含量的影響

由圖5可知，柚子酵素中的總黃酮含量隨發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先增加后逐漸略減少的趨勢。當發(fā)酵時間為60 d時，柚子酵素中的總黃酮含量達到最大值為2.26 mg·mL-1。因此，選擇在52～68 d的范圍內(nèi)的發(fā)酵時間進行下一步的優(yōu)化試驗。

圖5 發(fā)酵時間對柚子酵素中總黃酮含量的影響圖

2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示。進行統(tǒng)計分析后得到預(yù)測模型為

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果表

Y=-37.361 8+0.198 1A+3.893 8B+1.521 9C+0.229 0D- 0.002 7A2-1.065 3B2-0.029 4C2-0.002 2D2+0.01AB+ 0.003 4AC-0.000 5AD-0.007 5BC+0.009 4BD+0.001 4CD，對上述回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，pModel＜0.000 1表示Box-Behnken試驗建立的統(tǒng)計模型有高度的顯著性。R2Adj為0.968 6， 表明此模型可解釋約96.86%的柚子酵素中總黃酮含量的變化；R2為0.984 3，表明建立的回歸方程對實驗的擬合度較好。由表3可知，A（紅糖添加量）、B（接種量）、A2、B2、C2和D2對柚子酵素中總黃酮含量的影響極顯著（p＜0.01）；D（發(fā)酵時間）和AC（紅糖添加量與發(fā)酵溫度）對柚子酵素中總黃酮含量的影響極顯著（p＜0.01）；C（接種量）、AB（紅糖添加量與接種量）、AD（紅糖添加量與發(fā)酵時間）、BC（接種量與發(fā)酵溫度）、BD（接種量與發(fā)酵時間）和CD（發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間）對總黃酮含量的影響不顯著（p＞0.05）。模型F值的大小與響應(yīng)值成正相關(guān)，F(xiàn)值越大重要性越大[27]。由表3可知，各自變量因素對柚子酵素中總黃酮含量的影響程度為：B（接種量）＞A（紅糖添加量）＞D（發(fā)酵時間）＞C（發(fā)酵溫度）。

表3 回歸模型的方差分析表

2.3 響應(yīng)面分析

紅糖添加量、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用對柚子酵素中總黃酮含量的影響的響應(yīng)面曲線及等高線見圖6。

圖6 各因素交互項對柚子酵素中總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

響應(yīng)曲面越陡峭表示因素之間的影響程度越大[28]。由圖6可知，柚子酵素中總黃酮的含量存在極高值。對柚子酵素中總黃酮含量的回歸方程求解，獲得最佳的工藝條件參數(shù)為紅糖添加量54.53%、接種量2.24%、發(fā)酵溫度30.19 ℃，發(fā)酵時間61.13 d。在此條件下，柚子酵素中的總黃酮含量理論上可達2.39 mg·mL-1。

根據(jù)試驗實際情況修正最佳工藝條件參數(shù)為紅糖添加量54.0%、接種量2.0%、發(fā)酵溫度30.0 ℃，發(fā)酵時間61 d。在最佳的工藝條件下重復(fù)3次平行試驗，實際測定柚子酵素中總黃酮的平均含量為 2.36 mg·mL-1，與預(yù)測值的相對誤差為1.2%，表明該模型具有良好的擬合度。

3 結(jié)論

本試驗采用Box-Behnken分析方法，以總黃酮含量為指標對柚子酵素的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化試驗。該方法制備的柚子酵素不但具有天然柚子芳香風味，而且通過發(fā)酵工藝去除了柚子中天然的苦味，適口性強。同時，該柚子酵素的發(fā)酵工藝參數(shù)，為進一步的實驗研究提供了依據(jù)，并在產(chǎn)業(yè)化中具有一定的指導意義。