不同填料性質(zhì)對(duì)SMX 去除率的影響及微生物的響應(yīng)特征

張啟文 楊紅薇 董曉明 羅景誠 江禹友

（西南交通大學(xué)地球科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，四川成都 610031）

1 引言

近年來，隨著抗生素的大規(guī)模生產(chǎn)和持續(xù)使用，大量抗生素進(jìn)入地表水和地下水體中，造成抗生素抗性基因和耐藥細(xì)菌的傳播，極大威脅著人類健康［1-2］。其中，磺胺甲 唑（Sulfamethoxazole，SMX）因具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特殊的化學(xué)性質(zhì)，在傳統(tǒng)的二級(jí)污水處理中難以高效去除［3］，是世界范圍內(nèi)各城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠出水中檢出頻率最高的抗生素［4-8］。城鎮(zhèn)污水處理廠作為抗生素進(jìn)入自然水體中重要的防線之一，對(duì)防治抗生素進(jìn)一步污染水環(huán)境具有重要作用，提高現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)對(duì)抗生素的處理效率勢在必行。

人工快速滲濾系統(tǒng)（Constructed Rapid Infiltration System，CRI 系統(tǒng)）在河道微污染水凈化、二級(jí)生物處理出水深度凈化、分散農(nóng)村生活污水處理等方面得到了廣泛的應(yīng)用［9-11］。其中，滲濾系統(tǒng)中填料是核心，它既是吸附阻截污染物的主體，也是微生物附著生長的載體。針對(duì)傳統(tǒng)的土壤滲濾系統(tǒng)，秦可娜通過添加粉煤灰使系統(tǒng)對(duì)SMX 的去除率由72.04%提高到79.16%，對(duì)紅霉素的去除率由64.41%提高到68.11%［12］；劉芹芹采用陶?；旌戏圪|(zhì)黏土、粗砂構(gòu)建模擬柱使甲氧芐啶和SMX 的去除效率分別達(dá)到80%～90%和60%～70%［13］，證實(shí)了強(qiáng)化填料吸附性能改良系統(tǒng)功能的可行性。然而，填料吸附性增強(qiáng)帶來的去除效率提高持久性及對(duì)微生物附著生長的影響不甚明確。日本的He 等人模擬花崗巖土、石英砂等3 種填料滲濾系統(tǒng)對(duì)27 種微量藥物和個(gè)人護(hù)理品（PPCPs）的去除，結(jié)果表明，填料吸附的增強(qiáng)強(qiáng)化了系統(tǒng)運(yùn)行效率，但對(duì)生物降解效果沒有影響［14］。因此，有必要針對(duì)滲濾填料吸附性與系統(tǒng)去除新興污染物的效果、系統(tǒng)微生物的響應(yīng)狀況開展研究，以便于進(jìn)一步明確滲濾系統(tǒng)凈化新興污染物的機(jī)理，為CRI 系統(tǒng)的進(jìn)一步改進(jìn)奠定基礎(chǔ)。

本文選取河沙、蛭石、火山巖和活性炭作為滲濾填料，構(gòu)建了室內(nèi)模擬系統(tǒng)，持續(xù)運(yùn)行1 年左右。在了解CRI 系統(tǒng)對(duì)SMX 去除效果的基礎(chǔ)上，分別從填料種類和填料粒徑探究了其對(duì)CRI 系統(tǒng)去除SMX的影響機(jī)制及微生物的響應(yīng)特征，為CRI 系統(tǒng)填料的優(yōu)化和工程運(yùn)行改進(jìn)提供參考。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 填料

本試驗(yàn)篩選了粗河沙、細(xì)河沙、蛭石、火山巖及活性炭作為備選填料，各填料的理化性質(zhì)見表1。填料經(jīng)自來水沖洗去除雜質(zhì)后，在100～103 ℃烘干放至常溫，稱取適量填料裝入模擬柱中，填料高度為40 cm。

表1 填料性質(zhì)及裝填參數(shù)

2.2 CRI 模擬試驗(yàn)

2.2.1 模擬柱的構(gòu)建

柱體試驗(yàn)裝置如圖1 所示。試驗(yàn)柱體為內(nèi)徑5 cm、高50 cm 透明有機(jī)玻璃柱。為避免柱體內(nèi)SMX 的光解，在柱體外表包裹錫紙。試驗(yàn)從柱體頂端進(jìn)水，以重力流方式從底端出水。

圖1 試驗(yàn)?zāi)M柱裝置示意

2.2.2 微生物接種及模擬柱的運(yùn)行

系統(tǒng)正式運(yùn)行前以豬糞水菌懸液和模擬廢水配制的接種液進(jìn)行微生物接種。待系統(tǒng)氨氮去除率基本穩(wěn)定后，在進(jìn)水中添加抗生素開展試驗(yàn)。以每天2個(gè)周期，水力負(fù)荷1.0 m3（/m2·d）運(yùn)行；每周期進(jìn)水10 min 后打開出水閥，收集周期內(nèi)出水水樣，混勻后取1.5 mL 過0.22 μm 濾膜于棕色取樣瓶中，4 ℃保存待測。系統(tǒng)運(yùn)行分成4 個(gè)階段，具體情況見表2。

表2 模擬柱4 個(gè)階段運(yùn)行的相關(guān)參數(shù)

2.2.3 試驗(yàn)水質(zhì)

試驗(yàn)用水為含30～140 μg/L SMX 的人工模擬城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠出水，配方見表3。

表3 人工模擬城鎮(zhèn)二級(jí)污水處理廠出水配方 mg/L

2.2.4 填料微生物采樣

系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后，在模擬柱運(yùn)行后期對(duì)附著于填料上的微生物開展了采樣。取各系統(tǒng)表層以下5 cm左右的土壤樣品各0.5 g，混勻后裝入經(jīng)121 ℃高壓滅菌的離心管中，存放于－20 ℃冰箱用于DNA 提取。

2.3 動(dòng)態(tài)吸附批量試驗(yàn)

按照2.2.1 的方法裝填完成后，在水力負(fù)荷為1.0 m3/（m2·d）條件下開展吸附試驗(yàn)。進(jìn)水分6 次完成，每批出水水樣單獨(dú)收集，混勻后取樣1.5 mL 存于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱存放待測。

2.4 試驗(yàn)藥品及儀器

藥品及試劑：SMX（色譜純，上海羅恩試劑廠）；K2HPO4、可溶性淀粉、NaHCO3、NH4Cl、葡萄糖、Mg－SO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、冰乙酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）。

試驗(yàn)儀器：高效液相色譜儀配紫外檢測器（Waters2695）；色譜柱（Symmetry C18，型號(hào)4.6 mm×150 mm）；電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A224）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101－3AB 型）；超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

2.5 測試指標(biāo)及檢測方法

pH 采用pH－10 筆式酸度計(jì)測試，水溫和電導(dǎo)率使用STARTER 3100c 電導(dǎo)率儀同時(shí)測定，氨氮采用UV－4802H 紫外分光光度計(jì)測定，測試方法為納式試劑法。

SMX 采用Waters 高效液相色譜儀配紫外檢測器檢測，測定條件為：Symmetry C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，恒定流速為0.8 μL/min，流動(dòng)相為甲醇與1‰冰乙酸35 ∶65 的比例，于270 nm 波長下檢測，SMX 出峰時(shí)間在4.9 min左右。

基于Illumina 高通量測序技術(shù)對(duì)土壤樣品的16S rRNA 基因V4－V5 區(qū)進(jìn)行微生物群落分析：采用Omega 公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit 試劑盒按說明書提取DNA，使用熒光分光光度計(jì)檢測DNA 濃度和質(zhì)量，調(diào)整DNA 溶液濃度；參考Su 等的方法選取引物及PCR 擴(kuò)增［15］。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并使用Axygen 公司凝膠試劑盒回收，回收產(chǎn)物用Microplate Reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）定量儀器進(jìn)行熒光定量。最后采用Illumina TruSeq DNA 文庫制備實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建上機(jī)測序文庫。

3 結(jié)果與討論

3.1 粗、細(xì)河沙填料模擬柱運(yùn)行結(jié)果對(duì)比（相同材質(zhì)不同粒徑）

粗河沙（粒徑0.3～1.0 mm）和細(xì)河沙（粒徑小于0.3 mm）模擬柱運(yùn)行各階段的去除效果見圖2a。運(yùn)行期間，去除率在23.2%～51.6%之間波動(dòng)。隨著運(yùn)行時(shí)間的增加，去除率呈逐步降低的趨勢。細(xì)河沙模擬柱填料粒徑更小，污染物與填料的接觸表面積更大，初期吸附性能略好于粗河沙（見圖2b），但從整體運(yùn)行效率來看，小粒徑帶來的初期吸附性能強(qiáng)化，對(duì)系統(tǒng)整體去除率并沒有顯著正效應(yīng)，反而是粗河沙模擬柱中微生物作用更強(qiáng)（見圖2c），使得系統(tǒng)整體去除效率更高。這與粗河沙大粒徑導(dǎo)致的系統(tǒng)孔隙率（粗河沙孔隙率19%，細(xì)河沙孔隙率6%）更高有關(guān)。有研究表明，好氧條件更有利于SMX 降解［16］，更大的孔隙率更有利于微生物的附著生長和系統(tǒng)復(fù)氧。系統(tǒng)內(nèi)微生物群落特征測試結(jié)果（見3.5）很好地印證了這一觀點(diǎn)，尤其是屬水平上的優(yōu)勢菌群伯克氏菌屬比例（粗河沙21.6%＞細(xì)河沙17.8%）與單周期SMX 微生物平均去除量表現(xiàn)出良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖2 粗、細(xì)河沙填料模擬柱性能對(duì)比

總的來說，相同材質(zhì)（河沙）條件下，小于0.3 mm的粒徑雖然吸附性能優(yōu)于0.3～1.0 mm 的粒徑范圍，但由于孔隙率偏低，不利于CRI 系統(tǒng)內(nèi)的氧擴(kuò)散和微生物降解，反而不利于SMX 的綜合去除。

3.2 細(xì)河沙、蛭石填料模擬柱運(yùn)行結(jié)果對(duì)比（相同粒徑不同材質(zhì)）

細(xì)河沙和蛭石填料模擬柱性能對(duì)比見圖3。

圖3 細(xì)河沙和蛭石填料模擬柱性能對(duì)比

細(xì)河沙和蛭石填料粒徑均小于0.3 mm，二者的運(yùn)行結(jié)果如圖3a 所示。整體來看，蛭石系統(tǒng)去除效果在前3 個(gè)階段略優(yōu)于細(xì)河沙柱體，這與蛭石吸附性能優(yōu)于細(xì)河沙有關(guān)，但隨著運(yùn)行時(shí)間的持續(xù)，吸附趨于飽和，微生物作用逐漸突顯，導(dǎo)致運(yùn)行后期即階段4 細(xì)河沙柱體去除效果優(yōu)于蛭石。從微生物對(duì)SMX 單周期去除量來看，細(xì)河沙明顯優(yōu)于蛭石（見圖3c）。考慮到蛭石和細(xì)河沙系統(tǒng)孔隙率（蛭石9%、細(xì)河沙6%）均處于極低水平，系統(tǒng)復(fù)氧困難，不利于微生物降解SMX 的情況，觀察填料表面狀況（見圖4），發(fā)現(xiàn)蛭石表面為光滑層狀結(jié)構(gòu)，與河沙相比，不利于微生物附著，這可能是導(dǎo)致其微生物作用整體較河沙弱的主要原因。

圖4 河沙和蛭石填料SEM 表面結(jié)構(gòu)

總的來說，相同粒徑范圍不同材質(zhì)條件下，模擬系統(tǒng)效能受吸附性能和微生物作用的綜合影響。當(dāng)吸附性能差異不大（＜5%）時(shí)，長期運(yùn)行（＞1 年）系統(tǒng)效能將主要受微生物影響，有利于微生物附著生長的填料去除效果更好。

3.3 粗河沙、火山巖填料模擬柱運(yùn)行結(jié)果對(duì)比（吸附能力相似，不同粒徑）

以粗河沙（粒徑0.3～1.0 mm）和火山巖（粒徑1.0～2.0 mm）為填料的模擬柱運(yùn)行情況如圖5a所示。火山巖的SMX 去除率在30.2%～51.6%之間，隨時(shí)間的變化總體趨勢仍是逐步降低，但火山巖模擬柱初期吸附性能略好，且微生物作用也較強(qiáng)，導(dǎo)致整體運(yùn)行情況均優(yōu)于粗河沙。比較而言，微生物作用的貢獻(xiàn)優(yōu)于吸附，說明粒徑更大的火山巖（孔隙率35%）比粗河沙（孔隙率19%）更有利于微生物的附著和降解，與3.1 中粗河沙去除效果優(yōu)于細(xì)河沙的規(guī)律一致。對(duì)照微生物響應(yīng)狀況，更大孔隙率的火山巖單周期SMX 微生物平均去除量表現(xiàn)更好（見圖5c），對(duì)應(yīng)屬水平上的優(yōu)勢菌群伯克氏菌屬比例也更高（火山巖26.3%＞粗河沙21.6%）。

圖5 粗河沙和火山巖填料模擬柱性能對(duì)比

總的來說，在填料對(duì)SMX 的吸附性能略好的情況下，若填料粒徑更大，孔隙率更高，系統(tǒng)的整體表現(xiàn)將更好。

3.4 火山巖、活性炭填料模擬柱運(yùn)行結(jié)果對(duì)比（相同粒徑，吸附能力差異巨大）

火山巖和活性炭填料模擬柱性能對(duì)比見圖6。

圖6 火山巖和活性炭填料模擬柱性能對(duì)比

火山巖和活性炭（粒徑均為1.0～2.0 mm）模擬柱運(yùn)行情況見圖6a，二者顯示出高達(dá)50%左右的去除率差異?；钚蕴繉?duì)SMX 的吸附能力顯著高于火山巖是其整體去除效果遠(yuǎn)優(yōu)于火山巖的主要原因，但另一方面，火山巖雖然孔隙率（35%） 高于活性炭（25%），但其微生物作用效果卻不如活性炭，分析認(rèn)為這是在孔隙率達(dá)到一定程度，系統(tǒng)復(fù)氧差異不大的情況下，生物作用效率高低就取決于有效微生物豐度。對(duì)照微生物群落多樣性測試結(jié)果，活性炭系統(tǒng)內(nèi)屬水平上的優(yōu)勢菌伯克氏菌屬豐度占比更高（活性炭達(dá)51.2%，火山巖僅26.3%），證實(shí)了上述分析。顯然，活性炭的微生物降解效率也高于火山巖，系統(tǒng)整體表現(xiàn)更好。由此認(rèn)為活性炭可作為改進(jìn)CRI 系統(tǒng)去除新興污染物效率的備選填料。

值得注意的是，活性炭對(duì)30～140 μg/L 的SMX高達(dá)100%的吸附效率，不但沒有表現(xiàn)出對(duì)附著微生物的顯著抑制效應(yīng)，反而提高了微生物群落中有利于SMX 降解的專性菌的占比，說明了抗生素SMX強(qiáng)烈的定向篩選作用。有學(xué)者研究顯示，包含SMX在內(nèi)的20 種藥物化合物在0～500 μg/L 濃度水平下，微生物酶活性未受到抗生素抑制［17］，這與本試驗(yàn)中微生物未受抑制的現(xiàn)象相符。

3.5 模擬CRI 系統(tǒng)內(nèi)微生物群落特征與SMX 去除的關(guān)系分析

模擬柱運(yùn)行后期，對(duì)各系統(tǒng)填料表面微生物進(jìn)行采樣并開展Illumina 高通量測序分析。表4 列出了指示微生物多樣性的Shannon 指數(shù)?？梢园l(fā)現(xiàn)，活性炭填料上的微生物群落多樣性顯著低于其他模擬柱，這是由于活性炭吸附大量SMX 后對(duì)微生物產(chǎn)生強(qiáng)烈的定向篩選作用，導(dǎo)致微生物多樣性偏低。而SMX 去除效率相近的填料（如粗河沙和火山巖，細(xì)河沙和蛭石）其Shannon 指數(shù)也更接近。分析認(rèn)為這一多樣性特征受到系統(tǒng)復(fù)氧狀況的影響，粗河沙和火山巖系統(tǒng)孔隙率大，復(fù)氧能力更強(qiáng)，微生物受到SMX和氧的雙重條件定向篩選，導(dǎo)致微生物多樣性偏低。

表4 5 個(gè)模擬系統(tǒng)中微生物物種豐富度和多樣性

圖7 對(duì)5 個(gè)模擬系統(tǒng)在門水平上的微生物群落進(jìn)行了比較。5 個(gè)樣品共獲得27 個(gè)菌門，系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌群為變形菌門，平均豐度達(dá)56.8%，其中，在活性炭中該菌門相對(duì)豐度最高（79.0%），其余幾種填料中該菌門豐度差異較?。?8.0%～57.9%）。變形菌門在去除抗菌和抗炎物質(zhì)方面有重要的促進(jìn)作用［18］，在SMX 存在的情況下相對(duì)豐度最大，說明它具有耐藥性［19］。但值得注意的是，門水平的優(yōu)勢菌群豐度與前述各模擬柱運(yùn)行后期的單周期生物作用SMX平均去除量并沒有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖7 各模擬系統(tǒng)微生物群落在門水平上的差異

進(jìn)一步觀察屬水平上的優(yōu)勢菌微生物豐度水平，見圖8?？梢钥闯?，屬水平上的優(yōu)勢微生物伯克氏菌屬的豐度水平與各填料微生物作用強(qiáng)弱表現(xiàn)出良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明伯克氏菌屬可能是模擬系統(tǒng)內(nèi)降解SMX 的主要微生物。

圖8 各模擬系統(tǒng)微生物群落在屬水平上的差異

4 結(jié)論

通過不同填料的模擬CRI 系統(tǒng)試驗(yàn)，分析系統(tǒng)中填料粒徑、初始SMX 吸附能力的影響及系統(tǒng)內(nèi)微生物的響應(yīng)特征，主要得出以下結(jié)論：

在1.0 m3/（m2·d）的水力負(fù)荷、每周期水力停留時(shí)間0.4～2 h 的條件下，粗河沙、細(xì)河沙、蛭石和火山巖的模擬CRI 系統(tǒng)對(duì)SMX 的總體平均去除率為23.2%～51.6%，隨時(shí)間呈顯著下降的趨勢，1 年后去除率僅為初始階段的50%左右。

在30～140 μg/L 的SMX 進(jìn)水濃度下，活性炭持續(xù)表現(xiàn)出高于92.5%的SMX 平均去除率；系統(tǒng)微生物多樣性測定表明，伯克氏菌屬豐度占比高達(dá)51.2%，表現(xiàn)出顯著的微生物定向篩選作用。活性炭可作為改進(jìn)CRI 系統(tǒng)去除新興污染物效率的備選填料。

在0.3～2.0 mm 的粒徑范圍吸附量差異不大的填料，裝填孔隙率偏大更有利于微生物對(duì)SMX 的去除，對(duì)應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)勢微生物伯克氏菌屬的豐度更高。

值得注意的是，經(jīng)過約1 年的SMX 定向篩選作用，各模擬柱運(yùn)行后期的SMX 生物降解量，與各填料上附著微生物在門水平上的優(yōu)勢菌群豐度并沒有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，卻與屬水平上的優(yōu)勢微生物伯克氏菌屬的豐度水平有著良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，該現(xiàn)象可為利用屬水平的優(yōu)勢微生物豐度指示系統(tǒng)微生物作用強(qiáng)弱提供參考。