異檸檬酸脫氫酶基因突變的彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤中α地中海貧血伴智力低下綜合征基因缺失與1p/19q聯(lián)合缺失的表達(dá)分析

王君祥 孫成法 褚榮濤 姜 華 龔銘杰 周幽心 李學(xué)濤

1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬常熟醫(yī)院暨常熟市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇蘇州215500；2.蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇蘇州215006

膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，惡性程度不一。世界衛(wèi)生組織最新的關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤分類將膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤稱為4級(jí)膠質(zhì)瘤，惡性程度最高，而2～3級(jí)彌漫型膠質(zhì)瘤（包括彌漫性星形細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤和間變性少突膠質(zhì)瘤）可稱為彌漫型較低級(jí)別膠質(zhì)瘤[1]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突變能更好地評(píng)價(jià)類似組織學(xué)分型腫瘤的預(yù)后，但對(duì)于同樣IDH分型的較低級(jí)別膠質(zhì)瘤，利用相關(guān)基因變異如α地中海貧血伴智力低下綜合征基因（X-linked alpha thalassemia mental retardation syndrome gene，ATRX）缺失或1號(hào)染色體短臂和19號(hào)染色體長(zhǎng)臂（1p/19q）共缺失判斷其亞型及預(yù)后的相關(guān)領(lǐng)域尚待深入研究[2-3]。

本研究的目的是評(píng)價(jià)ATRX缺失和1p/19q聯(lián)合缺失在IDH突變的較低級(jí)別彌漫性膠質(zhì)瘤患者中判斷其亞型及評(píng)價(jià)其預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

IDH突變型成人較低級(jí)別彌漫性膠質(zhì)瘤患者142例，選 自2012年6月 至2017年6月 確 診并在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院和常熟市第二人民醫(yī)院手術(shù)及放化療治療的病例。其中平均隨訪時(shí)間40個(gè) 月（10～88個(gè) 月），男77例，女65例，年 齡30～62歲。包括彌漫性星形細(xì)胞瘤55例、間變性星形細(xì)胞瘤45例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤22例、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤20例，依據(jù)組織學(xué)分型分為星形細(xì)胞瘤與少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤兩組。組織病理學(xué)診斷符合2015WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[2]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①成人初次發(fā)??；②術(shù)后病理確診為彌漫型較低級(jí)別膠質(zhì)瘤；③分子檢測(cè)IDH陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)?fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤；②10個(gè)月內(nèi)失訪。本研究研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)，研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 膠質(zhì)瘤ATRX缺失的檢測(cè)

切片脫蠟后滴加ATRX多克隆抗體[Sigma-Aldrich公司（美國(guó)），HPA001906，1∶2000]，按照Envision二步法染色。陰性對(duì)照以緩沖液代替一抗進(jìn)行孵育，細(xì)胞核棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。免疫組織化學(xué)陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：于每張切片挑選染色均勻5個(gè)不相鄰高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。以ATRX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%定義為陽(yáng)性（ATRX表達(dá)），以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%定義為陰性（ATRX表達(dá)缺失）[4]。所有試驗(yàn)都包括陽(yáng)性對(duì)照樣本及陰性對(duì)照以確保染色質(zhì)量。

1.3 1p/19q聯(lián)合缺失的熒光原位雜交（FISH）

FFPF切片上使用Abbott Molecular，Inc.的兩組雙色探針，探針組（A）：LSI 1p36（TP73/MEGF6，spectrum orange）/1q25（ANGPTL1/ABL2，spectrum green）；探 針 組B：LSI 19q13（ZNF44/ZNF443/MAN2B1，spectrum green）/19p13（GLTSCR2/CRX，spectrum orange）。每組探針計(jì)數(shù)200（200）個(gè)細(xì)胞，缺失1p或19q（1個(gè)紅、2個(gè)綠信號(hào)）≥50%，或缺失1p36/1q25和19q13/19p13的信號(hào)比≤0.8，則提示1p或19q缺失[5]。

1.4 觀察指標(biāo)

①基于兩組患者ATRX缺失與1p/19q缺失情況，比較其與組織學(xué)分型之間相關(guān)性。②術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，隨后每6個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2020年6月，平均隨訪時(shí)間40個(gè)月（10～88個(gè)月）。生存時(shí)間（OS）定義為診斷到患者死亡或最后1次隨訪之間的時(shí)間。比較兩組患者中位生存時(shí)間與ATRX缺失及1p/19q聯(lián)合缺失之間的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)各參數(shù)間相關(guān)性的顯著性。Kaplan-Meier法估計(jì)生存率與ATRX缺失及1p/19q聯(lián)合缺失之間的關(guān)系，采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IDH突變彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤中ATRX缺失與1p/19q聯(lián)合缺失患者情況

共檢測(cè)142例成人IDH突變型彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者，患者一般資料見(jiàn)表1。

表1 IDH突變彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤中ATRX缺失與1p/19q聯(lián)合缺失患者情況

2.2 兩組ATRX表達(dá)缺失情況比較

免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)55.6%（79/142）的腫瘤患者有ATRX表達(dá)缺失。其中彌漫性星形細(xì)胞瘤43例，間變性星形細(xì)胞瘤35例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤1例。星形細(xì)胞瘤組中ATRX缺失顯著高于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表2及圖1a、b。

表2 兩組病例ATRX缺失情況比較[n（%）]

2.3 兩組1p/19q聯(lián)合缺失情況比較

FISH分析顯示，22.5%（32/142）的腫瘤患者存在1p/19q聯(lián)合缺失。其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤17例，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤15例。星形細(xì)胞瘤和間變星形細(xì)胞瘤未檢測(cè)到1p/19q聯(lián)合缺失。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組1p/19q聯(lián)合缺失顯著高于星形細(xì)胞瘤組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表3及圖1c、d、e、f。

表3 兩組病例1p/19q聯(lián)合缺失情況比較[n（%）]

圖1 彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤免疫組化及FISH結(jié)果（×400）注：a：星形細(xì)胞瘤，ATRX野生型；b：星形細(xì)胞瘤，ATRX缺失；c：星形細(xì)胞瘤，1p正常；d：少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，1p缺失；e：星形細(xì)胞瘤，19q正常；f：少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，19q缺失

2.4 ATRX缺失和1p/19q聯(lián)合缺失對(duì)預(yù)后的影響

星形細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤中，ATRX缺失的患者比野生型ATRX的患者生存時(shí)間更長(zhǎng)，中位生存時(shí)間分別為46個(gè)月和40個(gè)月。同樣，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者和間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中1p/19聯(lián)合缺失的患者預(yù)后明顯優(yōu)于1p/19q未缺失的患者，中位生存時(shí)間分別為53個(gè)月和42個(gè)月。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2～3。

圖2 彌漫性星形細(xì)胞瘤及間變性星形細(xì)胞瘤中不同ATRX表達(dá)患者的生存曲線

圖3 少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤與間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中不同1p/19q表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

ATRX是SWI2/SNF2 DNA解旋酶家族中的一員，在染色質(zhì)調(diào)控和端粒維護(hù)中發(fā)揮著重要作用[6]。ATRX突變與1p/19q聯(lián)合缺失互斥，但與p53突變相關(guān)，提示ATRX可能驅(qū)動(dòng)星形細(xì)胞瘤的譜系特異性形成[7]。在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中19q缺失及1p缺失較為常見(jiàn)，并且這些缺失經(jīng)常同時(shí)發(fā)生[8]。1p和19q的缺失被認(rèn)為是一個(gè)決定性的預(yù)測(cè)化療反應(yīng)和生存率的因素。目前認(rèn)為1p/19q聯(lián)合缺失是預(yù)后良好的相關(guān)因素[9]。

IDH突變已成為2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中的獨(dú)立分類因子[1]。既往研究表明，IDH突變?cè)谀z質(zhì)瘤尤其是彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤中起重要作用[10]。而在IDH突變的彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤中，ATRX缺失或1p/19q聯(lián)合缺失是否具有類似作用尚待進(jìn)一步研究。本研究共檢出79例ATRX缺失，絕大部分為星形細(xì)胞瘤，僅有1例為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。星形細(xì)胞瘤組中ATRX缺失率顯著高于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，本研究檢出1p/19q聯(lián)合缺失32例，均為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤組1p/19q聯(lián)合缺失率顯著高于星形細(xì)胞瘤組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明，上述基因突變具有較高的腫瘤特異性，可以用來(lái)鑒別星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤?；谶@些基因突變的分子進(jìn)行分類可能比組織學(xué)分類更準(zhǔn)確[11]。它們還可以用于糾正一些組織學(xué)分型中的一些誤差。正如Kim等[12]所指出的，本研究中存在ATRX缺失的“少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤”更適合診斷為星形細(xì)胞瘤。

一些研究指出，具有IDH突變的彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤的療效優(yōu)于野生型的同級(jí)別膠質(zhì)瘤[13-14]。但是同樣IDH突變的患者，其預(yù)后影響因素尚待進(jìn)一步研究。本研究表明，雖然發(fā)病年齡相近，ATRX缺失的較低級(jí)別星形細(xì)胞瘤患者的中位生存時(shí)間比ATRX野生型患者要長(zhǎng)，中位生存時(shí)間分別為46個(gè)月和40個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這意味著在星形細(xì)胞瘤中，盡管組織學(xué)分型相似，ATRX缺失的腫瘤患者預(yù)后較ATRX野生型更優(yōu)。類似的，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中，盡管組織學(xué)分型相似，1p/19q聯(lián)合缺失的腫瘤患者預(yù)后較1p/19q野生型更優(yōu)，中位生存時(shí)間分別為53個(gè)月和42個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，在IDH突變的彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤中，即使腫瘤組織學(xué)分級(jí)不同，ATRX缺失和1p/19q聯(lián)合缺失也可以作為這些腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，如果對(duì)這些基因突變有快速的檢測(cè)方法，針對(duì)這些腫瘤的綜合治療包括手術(shù)切除、放療和化療等，都可以得到更準(zhǔn)確的治療及評(píng)價(jià)手段。

已有研究指出基因靶向治療對(duì)IDH突變的膠質(zhì)瘤患者有良好的治療效果[15]。針對(duì)ATRX和1p/19q的基因靶向治療也有望在未來(lái)改善膠質(zhì)瘤的預(yù)后。