第二代測序技術(shù)用于全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染診斷的臨床價值

董伊隆 錢約男 李一民 劉良樂 蔡春元

假體周圍感染（periprosthetic jiont infection，PJI）是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥。PJI的正確診斷和病原體的確定是關(guān)節(jié)翻修手術(shù)的關(guān)鍵。而在臨床上，往往關(guān)節(jié)液常規(guī)細菌培養(yǎng)陰性。一些研究表明細菌培養(yǎng)陰性PJI的發(fā)病率達50%[1-2]。臨床醫(yī)生不知道感染的病原體，就無法有效地監(jiān)測患者對治療的反應(yīng)，并確定感染是否得到控制。因此，許多學(xué)者正致力于探索并評估一些新的PJI診斷指標(biāo)，以解決這一難題。

第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）是一種新的DNA/RNA測序方法[3]。NGS由于其成本低和檢測快速被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)，可以有效提高識別病原體的效率[3-4]。然而，NGS用于PJI患者的檢測鮮有報道，因此筆者對NGS用于PJI患者關(guān)節(jié)液中病原體的檢測進行了研究，并與常規(guī)細菌培養(yǎng)結(jié)果進行比較分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年1月1日至2019年12月1日溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診的全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（total knee arthroplasty，TKA）后臨床懷疑為PJI的15例患者，其中男6例，女9例；年齡57～81歲，平均66.5歲；置換術(shù)前均診斷為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。15例患者均行膝關(guān)節(jié)穿刺關(guān)節(jié)液細菌培養(yǎng)和NGS檢測。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初次TKA后；（2）TKA后出現(xiàn)體溫升高、膝關(guān)節(jié)皮溫升高，膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、積液、靜息痛、竇道或假體松動等癥狀和體征[5]，臨床懷疑PJI；（3）送檢關(guān)節(jié)液標(biāo)本符合NGS檢測細菌培養(yǎng)的要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤、自身免疫性疾病等非感染性疾病患者；（2）送檢標(biāo)本量不能滿足NGS檢測要求，或已被細菌污染；（3）拒絕簽署知情同意書者。

1.3 關(guān)節(jié)液采集 選擇皮膚完整處進行穿刺，常規(guī)消毒鋪巾。髕骨外上方穿刺，可由股四頭肌腱外側(cè)向內(nèi)下刺入關(guān)節(jié)囊；髕韌帶旁穿刺，可由髕骨下方膝眼處向后刺入關(guān)節(jié)囊；若上述穿刺失敗，可在超聲引導(dǎo)下進行穿刺抽液。抽取2份關(guān)節(jié)液，每份2 ml，1份進行常規(guī)細菌培養(yǎng)，1份進行NGS檢測。

1.4 細菌培養(yǎng) 關(guān)節(jié)液行常規(guī)需氧和厭氧菌培養(yǎng)；培養(yǎng)基分別為血平板、巧克力平板及BacT/Alert FN血培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)板放置于恒溫37.0℃培養(yǎng)箱，血培養(yǎng)瓶置于梅里埃血培養(yǎng)箱。所有標(biāo)本培養(yǎng)1周。

1.5 NGS測序

1.5.1 樣品保存 按照標(biāo)準(zhǔn)程序所采集的關(guān)節(jié)液即刻冷凍，保存溫度為-20℃。

1.5.2 DNA提取、文庫構(gòu)建及測序 采用TIANamp微DNA試劑（DP316，天根生化科技有限公司）直接從關(guān)節(jié)液中提取DNA。通過DNA片段化、末端修復(fù)、連接和PCR擴增構(gòu)建DNA文庫。Agilent 2100用于DNA文庫的質(zhì)量控制。通過BGISEQ-50平臺對質(zhì)量合格的DNA文庫進行排序[6]。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理與分析 通過去除低質(zhì)量、低復(fù)雜度、短于35 bp的讀數(shù)得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。利用BurraveWeler-Read數(shù)據(jù)處理和分析消除人類序列的影響[7]。然后將剩余的數(shù)據(jù)對準(zhǔn)微生物基因組數(shù)據(jù)庫，微生物基因組數(shù)據(jù)庫包括細菌、病毒和真菌等目前可以知曉的所有微生物。刪除重復(fù)讀取獲得映射數(shù)據(jù)，保留并最后分析高級數(shù)據(jù)。其中微生物基因組數(shù)據(jù)是從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下載（FTP://FTP.NCBI.NLM.NIH.gov）[8]。本研究所用數(shù)據(jù)庫包含2 473個細菌屬、4 061個與人類疾病相關(guān)的病毒種類、199個與人類感染相關(guān)的真菌種類和135個與人類疾病相關(guān)的寄生蟲，其資料來自SOAP網(wǎng)站（http://SOAP.GnEngor.org.cn）[9]。對細菌含量占總序列＞1%的細菌屬進行統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例數(shù)（率）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 15例患者關(guān)節(jié)液細菌培養(yǎng)和NGS檢測結(jié)果

2.1.1 細菌培養(yǎng) 15例TKA術(shù)后關(guān)節(jié)感染患者微生物培養(yǎng)陽性10例（其中例4同一標(biāo)本培養(yǎng)出2種細菌），分別培養(yǎng)出表皮葡萄球菌4例，金黃色葡萄球菌2例，停乳鏈球菌1例，黏液奈瑟菌1例，無乳鏈球菌1例，脆弱擬桿菌1例，大腸埃希菌1例；培養(yǎng)陰性5例，見表1。

2.1.2 NGS檢測 15例患者關(guān)節(jié)液中均發(fā)現(xiàn)細菌，其中例1至例10 NGS檢測細菌菌屬與細菌培養(yǎng)結(jié)果一致。除了例4外，其余9例NGS檢出的優(yōu)勢菌群與細菌培養(yǎng)結(jié)果一致。例7、8、9 NGS檢測僅檢出1種細菌屬，且均與細菌培養(yǎng)結(jié)果一致。細菌培養(yǎng)陰性的5例中，例11檢出1種細菌，為大芬戈爾德菌（85.69%），例12僅檢出鏈球菌屬（76.98%），例13檢出2種細菌，為葡萄球菌屬（90.38%）和奈瑟菌屬（10.62%），例14僅檢出厭氧菌屬（89.27%），例15僅檢出念珠狀鏈桿菌（79.85%），見表1。

表1 15例患者關(guān)節(jié)液細菌培養(yǎng)和N G S檢測結(jié)果

2.2 關(guān)節(jié)液細菌培養(yǎng)與NGS檢測結(jié)果的比較 在細菌培養(yǎng)陽性的10例標(biāo)本中檢出細菌屬種類10種，NGS檢出細菌屬種類15種，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042）；其中9例標(biāo)本NGS檢測出的優(yōu)勢菌群（豐度最高）與細菌培養(yǎng)一致。在細菌培養(yǎng)陰性的5例標(biāo)本，NGS均檢出細菌，其中例11、14和15為苛養(yǎng)菌。

3 討論

PJI是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者帶來了巨大的經(jīng)濟、心理負(fù)擔(dān)，增加患者術(shù)后病死率。PJI的發(fā)病率在全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后約為1%，而TKA后約為1%～2%[10]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，PJI已經(jīng)成為髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)的主要原因之一[11]，也是膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后翻修的首要原因[12]。治療過程艱巨，治療結(jié)果往往較差。為了最大限度地發(fā)揮治療效果，必須準(zhǔn)確識別病原體，正確的病原體鑒定對于獲得抗生素敏感性和減少抗生素的應(yīng)用范圍是必要的[13]。傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)液穿刺抽取培養(yǎng)已經(jīng)成熟，但仍存在一些缺陷。有文獻報道PJI假體周圍組織培養(yǎng)陽性率僅55.73%[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)液培養(yǎng)陽性率為66.67%（10/15），與上述文獻報道的培養(yǎng)陽性率接近，細菌培養(yǎng)陽性率不高。同時細菌培養(yǎng)所需的時間非常久，一般需要培養(yǎng)5 d，甚至更長時間才能得到細菌菌落[15]，影響抗生素的早期使用。但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法無法檢測到已經(jīng)形成生物膜的微生物，或者已經(jīng)在成骨細胞中被內(nèi)化的微生物。標(biāo)本中病原體的數(shù)量也會影響培養(yǎng)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，許多存在感染表現(xiàn)的患者常在獲得液體樣品之前進行了經(jīng)驗性抗感染治療，而關(guān)節(jié)液穿刺抽取前的抗生素治療可能產(chǎn)生假陰性培養(yǎng)物[16]。本研究培養(yǎng)陰性的5例標(biāo)本中，例12和例13檢查前使用抗生素。另外某些苛養(yǎng)菌不易培養(yǎng)。鑒于這些缺點，人們不得不探索更靈敏的檢測方法來檢測關(guān)節(jié)液中的PJI證據(jù)。

NGS檢測是一種簡單、復(fù)雜的快速、準(zhǔn)確的分子診斷方法。在每個操作中產(chǎn)生數(shù)百萬至十億個DNA/RNA序列的能力使得宏基因組分析比傳統(tǒng)的Sanger測序具有顯著的優(yōu)勢。它是一個無偏的分析，因為它可以放大和測序樣品的整DNA含量，而不使用任何引物或探針。理論上，無偏NGS有助于在一次測定中識別所有潛在的病原體。目前已釋放出43 000余株微生物基因組，包括38 000種細菌和5 000種病毒[17]，這些數(shù)據(jù)還含有人類病原體的重要代表，它們的可用性將對微生物病原體NGS檢測和應(yīng)用產(chǎn)生重大影響[17-18]，有助于識別常見、罕見甚至新病原體。理論上，幾乎所有病原體都可以根據(jù)長讀數(shù)的長度、微生物基因組的生命數(shù)、核酸的特定序列以及參考數(shù)據(jù)庫的完整性來確定。黃子達等[19]利用NGS檢測在假體周圍感染中的病原菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)液NGS診斷敏感度明顯高于關(guān)節(jié)液培養(yǎng)及組織培養(yǎng)。在本研究中，所有標(biāo)本NGS檢測均發(fā)現(xiàn)細菌，陽性率為100%，遠高于細菌培養(yǎng)的66.67%，結(jié)果同黃子達等[19]一致。在例4中，細菌培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)2種細菌，而NGS發(fā)現(xiàn)8種細菌；在例6中，細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)1種細菌，而NGS發(fā)現(xiàn)5種細菌。這2例患者為慢性感染患者，在取材之前經(jīng)多種抗生素的不規(guī)范治療，說明抗生素濫用導(dǎo)致多重細菌混合感染可能。例7、8、9、10系早期感染，例7術(shù)前存在牙周炎，例8術(shù)前存在尿路感染，說明關(guān)節(jié)置換術(shù)前要排除全身是否存在感染灶。例1、7的皮膚均有破潰流膿，考慮細菌毒力強，細菌培養(yǎng)提示金黃色葡萄球菌生長，同時在例1中，NGS檢出3種細菌，考慮外界環(huán)境中的細菌可能通過破潰口污染關(guān)節(jié)液。在細菌培養(yǎng)陰性的5例標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)例12、13術(shù)前使用抗生素，術(shù)前抗生素的使用影響培養(yǎng)的結(jié)果，而NGS可以直接讀取抗生素滅活細菌的殘留DNA。例11、14和15 NGS結(jié)果提示為苛養(yǎng)菌，可根據(jù)NGS結(jié)果選擇合適培養(yǎng)基后進行再次細菌培養(yǎng)和藥敏試驗。

同時，NGS存在許多不足之處：（1）僅能提示某種細菌感染，而無法給出對于臨床治療所需要的細菌藥物敏感。故目前臨床上可根據(jù)NGS的結(jié)果提示，選擇NGS所提示的細菌選擇合適的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)，并進行藥敏試驗；（2）NGS的靈敏度過高，對于已經(jīng)被滅活的細菌殘留DNA，亦能進行讀取，故降低了診斷的特異性；（3）NGS需要進行標(biāo)本的DNA提取、文庫構(gòu)建及測序，過程較為繁瑣，并且一個流程的失敗，將導(dǎo)致整個讀取的失?。唬?）相對于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)，NGS的費用較多，不適用于普及開展。

綜上所述，NGS是一種快速、準(zhǔn)確的的診斷方法，為常規(guī)細菌培養(yǎng)方法的補充，能檢出細菌培養(yǎng)以外的細菌，特別對于細菌培養(yǎng)陰性的標(biāo)本更具診斷意義。