介形類生物環(huán)境監(jiān)測與評價研究進展

唐振平,趙文惠,周 昆,黃 偉,劉 珊,賀海洋,陳 亮*

(1.南華大學 資源環(huán)境與安全工程學院,湖南 衡陽421001;2.稀有金屬礦產(chǎn)開發(fā)與廢物地質處置技術湖南省重點實驗室,湖南 衡陽421001;3.湖南綠礦工程建設有限公司,湖南 長沙410015)

0 引 言

許多環(huán)境污染問題隨著各行業(yè)的發(fā)展而產(chǎn)生，如礦冶污染[1-5]、粉塵污染[6]、農(nóng)業(yè)相關污染[7-12]等，這些環(huán)境問題對自然生態(tài)系統(tǒng)及人類健康均會造成較大傷害[13-14]。在礦冶過程中，由于受各方面技術限制，產(chǎn)生大量廢氣、廢水和固體排放物，這些污染物將嚴重影響周邊生態(tài)環(huán)境[3-5]。國內(nèi)許多地區(qū)頻繁出現(xiàn)灰霾、霧霾等災害性天氣，研究表明，粉塵是造成該現(xiàn)象的原因之一，其不僅降低周邊空氣質量，而且含有的重金屬離子隨降雨進入地表河道或地下水系將影響水體質量[6]。隨著農(nóng)業(yè)發(fā)展，農(nóng)藥、化肥、除草劑種類不斷增多，其不科學施用問題日趨嚴重，如長時間疊加殘留土壤中，將破壞土壤自身生態(tài)系統(tǒng)，致作物減產(chǎn)降質[7-13]。

隨著生物監(jiān)測與評價技術蓬勃發(fā)展，許多生物被作為指示性生物用于環(huán)境監(jiān)測與評價，介形類就是其中一種[15]。介形類屬節(jié)肢動物門介形綱，是一類小型甲殼動物，常見于內(nèi)陸水域，營底棲生活，有很強的環(huán)境適應性，并對環(huán)境污染有很強敏感性[16-17]。許多研究人員將介形類監(jiān)測與評價環(huán)境方法應用到不同的介質中，如道路粉塵[18-23]、土壤[24-26]、沉積物[27-42]和水體[43-50]等。J.M.Poquet[43]研究發(fā)現(xiàn)采礦活動影響介形類群落分布，在受污染地下水附近物種顯著減少。H.Watanabe[18]采用6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法，通過測定介形類死亡率和生長抑制兩項指標進行道路粉塵毒性評價，表明該生物對粉塵污染物具有較強敏感性。P.Oleszczuk[29]采用直接接觸實驗利用介形類對13種污水污泥毒性進行評價，表現(xiàn)出在相對較低毒性水平，該生物死亡率隨毒性增加而顯著增大。陳仕梅等[48]利用介形類(Physocypriakraepelini)進行急性毒性實驗，發(fā)現(xiàn)隨著Cd2+，Zn2+和Cu2+三種重金屬離子濃度增加及暴露時間延長，介形類死亡率不斷增加。為此，本文歸納總結介形類生物毒性實驗方法及國內(nèi)外利用該生物環(huán)境監(jiān)測與評價研究，指出利用介形類評估環(huán)境污染研究方向，以期為介形類生物監(jiān)測與評價提供思路。

1 介形類生物毒性實驗

毒性實驗是評估各種毒物影響生態(tài)系統(tǒng)的重要工具，被廣泛應用于特定生物指標測定以及了解生態(tài)系統(tǒng)健康狀況[51]。目前利用底棲動物進行急性毒性實驗是生物環(huán)境監(jiān)測與評價最常用的方法之一，通過分析生物半致死濃度(LC50)等相關指數(shù)確定污染等級[52-53]。針對不同介質，利用介形類進行毒性實驗可選擇不同的實驗方法，介形類監(jiān)測水體污染物一般選擇96 h經(jīng)典急性毒性實驗，固體介質污染物通常選擇6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法及14 d慢性毒性實驗進行污染物毒性監(jiān)測與評價。

1.1 介形類經(jīng)典急性毒性實驗

介形類利用經(jīng)典急性毒性實驗評價水體毒物毒性，可在較短時間內(nèi)獲得毒物相關信息。這種急性實驗程序簡單，可快速得出生物半致死濃度(LC50)，但存在實驗結果單一，使用動物數(shù)量多，測得生物半致死濃度(LC50)不穩(wěn)定的局限性。實驗具體流程及流程圖如圖1。

圖1 經(jīng)典急性毒性實驗流程圖Fig.1 Flow chart of classical acute toxicity test

1)該毒性實驗選取健康成年介形類，進行預實驗以確定最大無致死劑量(LD0)和絕對致死劑量(LD100)濃度。

2)正式實驗根據(jù)預實驗得到的質量濃度范圍對毒物設置等間距(等比或等差)劑量組，每個濃度設置3個平行實驗組和一個空白對照組。

3)取40 mL對應濃度的溶液(25 ℃，pH=7)放入50 mL燒杯作為一個實驗組，每組溶液中放入10只成體介形類，實驗期間不進行喂食。

4)設置24、48、72和96 h四個觀測時間點，記錄4個時間點介形類動態(tài)行為及死亡情況，及時進行清除死亡個體。

5)計算24、48、72和96 h各個時間點毒物對介形類的生物半致死濃度(LC50)和安全濃度(96 h LC50的1/100)。

1.2 介形類6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗

6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法(ISO 14371標準)由比利時根特大學環(huán)境毒理學和水生生態(tài)學實驗室開發(fā)[27]，是測定固體介質污染物對介形類(Heterocyprisincongruens)致死和亞致死效應的標準方法。該實驗生物選用可長期貯存的休眠Heterocyprisincongruens囊腫，并在毒性測試開始時孵化，該實驗方法將介形類暴露于沉積物6 d，觀察指標為死亡率和生長抑制。該實驗方法低成本、易操作，較多應用于介形類對沉積物、土壤的毒性監(jiān)測。實驗具體流程及流程圖如圖2。

圖2 6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗流程圖Fig.2 Flow chart of 6-day culture-free/maintenance direct contact experiment

1)將囊腫放入25 ℃，連續(xù)光照3 000～4 000 lx氣候箱進行孵化。孵化后用螺旋藻粉進行預喂養(yǎng)，并在顯微鏡下測量新鮮孵化的介形類長度。

2)實驗在12孔測試板中操作，各小孔添加1 cm3標準淡水，0.5 cm3沉積物和1 cm3藻類食物懸浮液，放入5只介形類，用封口膜密封各小孔并蓋上測試板蓋，靜置(25 ℃，黑暗，6 d)。

3)計算實驗組和對照組的死亡率及測定其生長長度。

4)處理和分析數(shù)據(jù)，得到半最大效應濃度(EC50)及半致死濃度(LC50)。

1.3 介形類14 d慢性毒性實驗

W.Niyommaneerat[20]指出6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗存在暴露周期過短、觀察指標過于單一的局限性，由此提出14 d慢性毒性實驗方法，八齡介形類平均第19天(第13～25天)開始產(chǎn)卵，該實驗的繁殖階段通常在暴露14 d后開始，因此認為毒物毒性在暴露階段結束時已經(jīng)對介形類繁殖、孵化產(chǎn)生影響。14 d慢性毒性實驗的暴露階段時長是依照6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法程序設計，其觀察指標為14 d死亡率和生長抑制及繁殖過程中平均壽命、產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵率等。在實驗過程中為避免藻類生長改變沉積條件、溶解氧水平和培養(yǎng)孔板內(nèi)食物量，選擇24 h黑暗作為光周期條件。實驗具體流程及流程圖如圖3。

圖3 14 d慢性毒性實驗流程圖Fig.3 Flow chart of 14-day chronic toxicity test

1)將囊腫放入25 ℃，連續(xù)光照。3 000～4 000 lx氣候箱中進行孵化，孵化后用螺旋藻粉進行預喂養(yǎng)，并在顯微鏡下測量新鮮孵化的介形類長度。

2)14 d慢性毒性實驗由三個連續(xù)部分組成:(1)14 d沉積物暴露階段，(2)繁殖階段，(3)孵化實驗。(2)、(3)均無沉積物。

(1)14 d沉積物暴露階段

實驗在12孔測試板中操作，各小孔添加1 cm3標準淡水，0.5 cm3沉積物和1 cm3藻類食物懸浮液，放入5只介形類，用封口膜密封各小孔并蓋上測試板蓋，靜置(25 ℃，黑暗，14 d)。在沉積物暴露階段第7天，每孔去除2 mL上覆水后，添加1 mL藻類食物懸浮液(1 mg/mL)。在實驗開始、沉積物暴露階段第7天和第14天測量上覆水體pH、電導率和鹽度。暴露階段終點測量包括14 d死亡率和生長抑制。

(2)繁殖階段

該階段在14 d暴露期后，一直持續(xù)至介形類全部死亡，將暴露階段存活的介形類從微孔板轉移到新12孔微孔板(每孔一個)，每孔含有1 mL標準淡水和0.5 mL藻類食物懸浮液(1 mg/mL)，不含沉積物，并在25 ℃黑暗環(huán)境中孵育直至繁殖階段結束，24 h記錄一次介形類死亡率和繁殖狀況，將存活介形類再次轉移至新12孔微孔板并測定其遷移前后上覆水體pH、電導率和鹽度。繁殖階段終點測量平均壽命、產(chǎn)卵總數(shù)、平均產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵率。

(3)孵化階段

孵化階段與繁殖階段應同時進行，在第一次產(chǎn)卵后開始(14 d)。每隔一天采集新生卵，并將卵轉移至含有舊藻類食物懸浮液的新12孔微孔板上進行孵化觀察，將微孔板置于25 ℃黑暗中保存，24 h檢查一次孵化狀況。孵化階段終點測量孵化率。

2 介形類監(jiān)測與評價

2.1 固體介質監(jiān)測與評價

2.1.1 道路粉塵監(jiān)測與評價

道路粉塵毒性物質主要是疏水有機化合物、重金屬、石油碳氫化合物、苯和多環(huán)芳烴等[31-32]。R.Khanal[19]在日本東京及其周圍城市主干道收集10個道路粉塵樣本，利用介形類進行6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法發(fā)現(xiàn)，影響多環(huán)芳烴含量變化主要因素是干旱天氣周期、車流密度等，對多環(huán)芳烴組分分析發(fā)現(xiàn)其主要來源為石化燃燒。H.Watanable[18]詳細了解采樣點信息，包括車流密度、粉塵收集率、粒子大小分布以及前期干旱天氣周期，采用真空吸塵器(HITACHI CV 100S6)收集粉塵樣本，通過2 000 μm尼龍網(wǎng)過濾，放入烘干箱進行干燥(小于2 000 μm的道路灰塵顆粒被認為是道路粉塵)，利用6 d免培養(yǎng)/免維護直接接觸實驗方法及14 d慢性毒性實驗兩種方法對比測試粉塵毒性，表明道路污染程度與介形類死亡率呈正相關。W.Niyommaneerat[20]為評估日本東京及周邊道路粉塵毒性，采用6 d免維護/免培養(yǎng)方法，利用不同固液比對道路粉塵進行毒性實驗以評價其毒性變化。本實驗進行24 h時，從固液混合物中分離出的濕道路粉塵對介形類無致命毒性，而混合物水溶性部分出現(xiàn)介形類高死亡率狀況，在塵水混合物保持7 d后，濕路塵和水溶性組分對介形類均具有致死毒性，表明道路粉塵毒物主要存在于水溶性組分以及介形類對粉塵污染物具有較強敏感性。

2.1.2 土壤監(jiān)測與評價

土壤是由有機、無機膠體結合組成的膠體體系，對毒物有很強的吸附能力[30]。當出現(xiàn)工業(yè)固體廢物亂堆、濫用農(nóng)藥化肥及生活廢水亂排放等現(xiàn)象時，周圍土壤易受到污染，生物豐度降低。V.Rossi[24]研究發(fā)現(xiàn)除草劑、殺蟲劑和化肥的不科學使用造成研究區(qū)域介形類豐富度降低。G.M.Cuppen[25]通過實驗分析不同種類、不同劑量農(nóng)藥對介形類的影響，發(fā)現(xiàn)該生物敏感性類似或高于片腳類、橈足類、對蝦及小龍蝦，是非常好的環(huán)境污染指示生物。F.Wang[26]同樣采用6 d免培養(yǎng)/免維護方法測試土壤鋅污染，發(fā)現(xiàn)介形類死亡是由于該生物與固相顆粒中(不可溶)毒物結合，而非溶解于水相中的毒物。

2.1.3 水系沉積物監(jiān)測與評價

受人類活動影響，特別是在人口密集地區(qū)，水體污染嚴重[35-38]。污染物進入水體通過沉淀作用進入沉積物，不發(fā)生遷移和降解可在其中長期積累儲存，成為污染物匯集地，因此水體沉積物污染物含量能反映水體污染狀況[39-42]。

許多沉積物毒性實驗[29-32]均采用6 d免培養(yǎng)/免維護方法進行測試。S.Magda[31]研究中，介形類(Chironomusriparius)采集于印度勒克瑙某魚塘，實驗前進行樣本預培養(yǎng)直到生物機能基本穩(wěn)定開始實驗，實驗結束后對所有存活介形類進行計數(shù)并測量，通過對比參考沉積物，確定其死亡率并測定存活介形類生長抑制百分比，證實該生物評價沉積物污染的有效性。B.Chial[28]將6 d免培養(yǎng)/免維護方法應用于佛蘭德和加拿大三條河流沉積物研究，發(fā)現(xiàn)在檢測和定量沉積物毒性方面，介形類敏感性與跳蟲相當，甚至在一些樣品中比跳蟲更敏感。P.Oleszczuk[29]采用比利時根特大學研究小組開發(fā)的微型生物測試(OstracodoxkitF)對13種廢水凈化過程產(chǎn)生的污水污泥毒性進行評價，表明污泥在多環(huán)芳烴含量較低劑量下表現(xiàn)出相對較低的毒性水平，劑量增加可顯著增大毒性。

2.2 水體監(jiān)測與評價

目前國內(nèi)外利用介形類在水體監(jiān)測與評價方面已開展較多研究。F.Ruiz[16]研究發(fā)現(xiàn)工業(yè)集中區(qū)附近污染水域，介形類通常非常稀少，甚至會消失。S.Iepure[44]對賈拉馬河流域介形類群落結構、多樣性、豐度和生態(tài)種群結構等研究發(fā)現(xiàn)，在微量金屬中度污染地點，介形類數(shù)量和多樣性相對較高，并存在嚴格的地下分類單元，過度污染的地域無介形類。采礦活動對介形類群落產(chǎn)生了類似影響，受污染地下水附近發(fā)現(xiàn)介形類數(shù)量迅速減少。陳亮等[17]研究湖南某鈾礦發(fā)現(xiàn)，鈾及釷含量隨水體與礦冶區(qū)距離增加明顯降低，介形類豐度則有所增大，Cypridopsisvidua和Heterocyprisincongruens兩種屬種豐度與水體鈾濃度呈顯著負相關，可利用其豐度變化對水體鈾濃度變化指示，豐度越大，鈾含量越低，反之亦然。B.S.Khangarot[45]在印度勒克瑙某校魚塘中收集淡水介形類(CyprissubglobosaSowerby)，并對其進行急性毒性實驗，元素毒性大小排列結果為Ag>Pt>Hg>Cu>Pd>Cd>Zn>Cr3+>U>Mn>Se>Cr6+>Bi>Pb>Sn>Al>Zr>Te>Ni>Fe>K>Ca>Mg>B，且介形類死亡率隨暴露期延長顯著增高。J.B.Sevilla[46]通過攝食和暴露于水體兩種途徑對淡水介形類(Heterocyprisincongruens)進行Cu、Cd和Zn毒性研究，結果發(fā)現(xiàn)，膳食中Cd、Cu毒性死亡率分別為47%與100%，當介形類同時暴露于溶解鋅和食物鋅時，死亡率幾乎相同，當將水和飲食中Cd劑量-反應關系與Cu和Zn的劑量-反應關系進行比較發(fā)現(xiàn)該生物死亡率結果相差較大。因此，在評估金屬對介形類毒性作用時，暴露途徑(水生途徑和飲食途徑)均很重要。M.Shuhaimi-Othman[47]利用成年介形類進行為期4 d的Cu、Cd、Zn、Pb、Ni、Fe、Al和Mn靜態(tài)毒性實驗，發(fā)現(xiàn)Cu、Cd、Zn、Pb、Ni、Fe、Al和Mn 96 h的LC50分別為25.2、13.1、1 189.8、526.2、19 743.7、278.9、3 101.9和510.2 μg/L，表明介形類對重金屬敏感性方面與大型水蚤相似。陳仕梅等[48]利用介形類(Physocypriakraepelini)進行急性毒性實驗，發(fā)現(xiàn)Cd2+，Zn2+和Cu2+三種重金屬離子在Physocypriakraepelini體內(nèi)均出現(xiàn)積累，隨著離子濃度不斷增加及暴露時間延長，介形類死亡率不斷增加。Cu2+對水生動物的毒性作用是其干擾某些蛋白前體合成，破壞組織器官，Zn2+是生物體內(nèi)許多酶所必需的一種離子，對介形類生長發(fā)育十分重要，但大量攝入則干擾Ca吸收而引起中毒。

3 結論及展望

本文在各行業(yè)污染介紹基礎上，詳細總結介形類在固相及水體介質監(jiān)測與評價的具體實驗方法。系統(tǒng)分析國內(nèi)外利用該生物環(huán)境監(jiān)測與評價結果，明確其對毒物有較高敏感性，證明介形類是一種良好環(huán)境污染指示性生物。

雖然介形類監(jiān)測在環(huán)境監(jiān)測與評價等方面得到較多應用，但有部分方面亟待優(yōu)化:

1)解決生物標準化問題。實驗選擇的介形類通常在野外進行采集，其生活在自然環(huán)境，除受到污染物影響外，還受氣候、季節(jié)、地域、土壤等環(huán)境因子影響。生物生長及群落分布差異很大，因此需建立標準化的培養(yǎng)介形類生物方法、明確其作為生物監(jiān)測指示生物的監(jiān)測指標，使研究數(shù)據(jù)具有可對比性。

2)完善介形類監(jiān)測數(shù)據(jù)庫。介形類監(jiān)測目前較多實驗為單一屬種對單一毒物的急性實驗測定，但現(xiàn)實環(huán)境污染狀況復雜，應多進行聯(lián)合慢性毒性實驗，充實介形類污染物測定數(shù)據(jù)庫，確保監(jiān)測出毒物并及時作出響應。

3)建立介形類行為模型。隨著科學技術快速發(fā)展，可利用各種傳感器及圖像捕捉技術對介形類動態(tài)行為進行監(jiān)測研究，總結其在不同環(huán)境下(不同溫度、酸堿度、硬度及各種污染物等)的動態(tài)行為，建立完善的介形類行為模型，分析其行為軌跡數(shù)據(jù)評價污染物毒性，準確監(jiān)測水質污染狀況。

4)優(yōu)化介形類實驗室培養(yǎng)/維護技術。研究各種群的最佳生長環(huán)境，提高存活率，快速、持續(xù)繁殖，擴大種群數(shù)量。野外采集樣品進行室內(nèi)培養(yǎng)，實驗室應盡可能還原采區(qū)環(huán)境參數(shù)。