龜紋瓢蟲生長發(fā)育及卵巢與濾泡上皮細胞的研究

皇甫寧博，高雪珂，王麗，朱香鎮(zhèn)，張開心，李東陽，姬繼超，雒珺瑜，崔金杰

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000）

我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)田作物經(jīng)常遭受多種病蟲的危害，常年因病蟲造成的作物損失達25%～30%， 重災年份某些作物損失可在50%以上，甚至絕收[1]。 此外，我國農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和耕作制度不斷變更，加上異常氣候愈發(fā)頻繁，使得農(nóng)作物病蟲防控工作面臨新的挑戰(zhàn)[2]。而目前，化學防治仍然是我國農(nóng)田的主要害蟲防治方法[3]。 該防治方法可有效快速地達到防治目的，對農(nóng)作物的豐產(chǎn)豐收起到重要的保障作用。 但是，隨著化學農(nóng)藥的高頻次、高劑量使用，其對生態(tài)環(huán)境的嚴重污染和農(nóng)藥使用者的身心健康的威脅已成為世界各國研究學者關(guān)注的焦點和熱點[4]。 生物防治是指利用一種生物對另外一種生物進行預防和調(diào)控的防治方法，可在很大程度上避免使用化學農(nóng)藥帶來的生態(tài)環(huán)境污染，減少施用農(nóng)藥引起的中毒事件的發(fā)生，因此越來越受到人們的重視[5]。

龜紋瓢蟲（Propylea japonica）屬鞘翅目、瓢甲科，在我國分布廣泛，對環(huán)境條件的適應性廣，是我國農(nóng)田害蟲的一種種群數(shù)量較大的優(yōu)勢捕食性天敵[6-7]，其幼蟲和成蟲均可大量捕食農(nóng)田害蟲，成蟲一晝夜在棉田最多可捕食棉蚜226 頭[8]、棉鈴蟲卵21 粒[9]。 因此，若能大規(guī)模人工飼養(yǎng)龜紋瓢蟲并適時釋放到田間，將對農(nóng)田害蟲的防治具有重要意義。 然而，在人工飼養(yǎng)時，只有飼喂活體害蟲的龜紋瓢蟲才能進行正常繁殖[10]；而人工飼料飼喂繁殖尚未完全成功，主要問題是人工飼料飼養(yǎng)的龜紋瓢蟲成蟲產(chǎn)卵前期長，產(chǎn)卵量少[11]?？梢?，為解決當前人工擴繁難題，明確龜紋瓢蟲的生長發(fā)育、生殖發(fā)育相關(guān)參數(shù)以及卵發(fā)生和濾泡上皮細胞發(fā)育規(guī)律至關(guān)重要。

因此，本研究通過室內(nèi)飼養(yǎng)試驗確定龜紋瓢蟲各蟲態(tài)發(fā)育歷期、體長、體寬及產(chǎn)卵量，通過顯微觀察和細胞骨架染色的方法，明確龜紋瓢蟲的卵巢濾泡上皮細胞的動態(tài)變化規(guī)律，以期為進一步研究龜紋瓢蟲生殖發(fā)育調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

龜紋瓢蟲種群在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所溫室養(yǎng)蟲室連續(xù)純化多代， 并置于紗網(wǎng)籠（25 cm×25 cm×25 cm）中進行飼養(yǎng)，每籠放4 盆接有豌豆修尾蚜（Meguora crassicaudoMordvilko）的蠶豆苗，并根據(jù)其生長狀況定期更換帶豌豆修尾蚜的新鮮植株。 龜紋瓢蟲的實驗室飼養(yǎng)條件：光照時間/黑暗時間為14 h/10 h，溫度（25±1）℃，相對濕度60%±5%。 豌豆修尾蚜的實驗室飼養(yǎng)條件： 光照時間/ 黑暗時間為14 h/10 h， 溫度（20±1）℃，相對濕度60%±5%。

1.2 試驗所用工具及試劑

1.2.1試驗工具。 解剖鑷、解剖針、載玻片、蔡司顯微鏡彩色相機（Zeiss Axiocam 305 color camera，德國）、體視解剖顯微鏡（Zeiss SteREO Discovery V8 stereomicroscope， 德國）、 熒光體視顯微鏡（Axlo ZooM.V16，德國）。

1.2.2試 劑。 Alexa Flour488 Phalloidin（Invitrogen，美國）、Hoechst 33342（Sigmae-Aldrich，美國）、5%（質(zhì)量分數(shù)）BSA 封閉液、Triton X-100（購自北京索萊寶科技有限公司）、4%（質(zhì)量分數(shù)）多聚甲醛（購自上海源葉生物科技有限公司）、抗熒光淬滅封片液（購自碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1龜紋瓢蟲生長發(fā)育觀察。 收集相同時期孵化的龜紋瓢蟲幼蟲，放入培養(yǎng)皿中，每天放入足量豌豆修尾蚜進行飼喂，利用Zeiss Axiocam 305 color camera 和Zeiss SteREO Discovery V8 stereomicroscope， 對龜紋瓢蟲1 齡、2 齡、3 齡和4 齡幼蟲、蛹、雌成蟲進行拍照，測量體長和體寬，每天定時觀察記錄龜紋瓢蟲蛻皮和發(fā)育情況。 將羽化后成蟲采用7 mL 離心管配對，并單對飼養(yǎng)，記錄單頭雌成蟲每天產(chǎn)卵量，直到試蟲死亡。 每個蟲態(tài)均設(shè)15 個重復，每個重復用1 頭試蟲。

1.3.2龜紋瓢蟲卵巢解剖和濾泡上皮細胞動態(tài)變化。收集成對飼養(yǎng)的龜紋瓢蟲雌成蟲，在1×磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）中活體解剖，先用鑷子去除足和鞘翅，然后分離胸部和腹部，保留完整的腹部，再用鑷子從腹部側(cè)面慢慢撕開位于腹部背面的表皮組織， 露出整個卵巢，除去腸道和卵巢周邊脂肪組織，用PBS 緩沖液沖洗3 次。

羽化后1～5 d，記錄每個卵巢管發(fā)育成熟卵數(shù)以及卵泡個數(shù)。分別選取羽化后1 d、3 d、5 d 的成蟲，從其卵巢中剝離單獨卵巢小管，除去卵巢小管外面包裹的膜鞘，用4%（質(zhì)量分數(shù)）多聚甲醛于室溫固定20 min，之后用1×PBS 進行沖洗，去除多聚甲醛殘留。 將固定并洗滌好的卵巢小管放于0.3%（體積分數(shù)）PBST（1×PBS 中加入0.3%Triton X-100）中，室溫下穿膜20 min，洗滌去除PBST 殘留， 加入Alexa Flour488 Phalloidin 濃度為0.165 μmol·L－1的PBS-BSA 緩沖液， 于室溫下避光溫育30 min 后進行細胞骨架染色，再次洗滌后加入含5 μmol·L－1Hoechst 33342 的PBS緩沖液中，于室溫、避光條件下溫育30 min，之后再次洗滌去除染料殘留，放在載玻片上滴加抗熒光淬滅封片液，利用AXLO ZooM.V16 熒光顯微鏡進行拍照觀察。 每個處理均設(shè)置9 個生物學重復，每個重復用1 頭雌蟲。

1.4 統(tǒng)計分析

分別采用SPSS 22.0 和Graphpad Prism 6 進行數(shù)據(jù)分析和作圖， 采用Photoshop 和Adobe Illustrator 2020 軟件進行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 龜紋瓢蟲的生長發(fā)育與產(chǎn)卵量

2.1.1龜紋瓢蟲不同蟲態(tài)體長與體寬。1～4 齡龜紋瓢蟲幼蟲中，2 齡到3 齡的體長增加最快，平均每天增長3.76 mm±1.03 mm，4 齡時達到最長體長9.32 mm±0.27 mm（圖1A）。 體寬的增長趨勢和體長基本一致，均隨著龜紋瓢蟲齡期的增加而增加， 其中幼蟲在4 齡期體寬為2.91 mm±0.14 mm，蛹期體寬為3.27 mm±0.08 mm，雌成蟲體寬為3.70 mm±0.05 mm， 蛹期總體上較幼蟲期更寬（圖1B）。

2.1.2龜紋瓢蟲發(fā)育歷期和產(chǎn)卵量。 龜紋瓢蟲1齡、2 齡、3 齡、4 齡幼蟲平均歷期分別為1.13 d±0.09 d、1.48 d±0.11 d、1.34 d±0.08 d 和2.34 d±0.06 d，蛹期平均歷期為2.81 d±0.08 d，雌成蟲平均歷期為51.08 d±1.13 d， 雄成蟲平均歷期為48.36 d±1.29 d， 雌性和雄性成蟲平均歷期無顯著差異（圖2A）。產(chǎn)卵前期為5.09 d±0.79 d，約在第10 天達到產(chǎn)卵高峰期， 單雌日均產(chǎn)卵量最高為14.42 粒±2.36 粒（圖2B），在第20 天之后產(chǎn)卵量逐漸下降。 平均單雌累計產(chǎn)卵量為414 ?！?1.27 粒，最高可達654 粒。

2.2 龜紋瓢蟲卵巢形態(tài)特征與發(fā)育級別劃分

2.2.1雌性生殖系統(tǒng)和卵巢管形態(tài)與結(jié)構(gòu)。 龜紋瓢蟲雌性生殖系統(tǒng)包括1 對卵巢、1 對側(cè)輸卵管、1 條中輸卵管、1 個受精囊、1 個生殖腔（圖3A）。龜紋瓢蟲卵巢為端滋式卵巢， 每側(cè)卵巢包括9～12 個卵巢小管，卵巢小管被端部端絲包被纏繞束縛一起（圖3A）。 成熟的卵巢管由端絲、原卵區(qū)和生長區(qū)3 個部分組成（圖3A～B）。卵巢管內(nèi)不同位置有不同發(fā)育階段的卵細胞（圖3C）。

2.2.2龜紋瓢蟲卵巢發(fā)育分級。 對羽化后1～5 d龜紋瓢蟲雌蟲卵巢進行解剖，統(tǒng)計成蟲羽化后卵巢管日平均成熟卵數(shù)以及處于不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)、卵巢管寬度，并根據(jù)這些參數(shù)把龜紋瓢蟲卵巢發(fā)育分為4 個級別（圖4）。Ⅰ級：成蟲羽化后1～2 d，開始能觀察到卵泡，沒有卵發(fā)育成熟，卵巢管寬度增加緩慢， 由第1 天的153.04 μm±5.77 μm 增加至第2 天的191.47 μm±7.56 μm；Ⅱ級：羽化后2～3 d，單個卵巢管至多出現(xiàn)2 個不同發(fā)育時期的卵泡，沒有卵發(fā)育成熟，卵巢管寬度開始快速增加， 由第2 天的191.47 μm±7.56 μm 增加至243.42 μm±16.70 μm； Ⅲ級：羽化后3～4 d， 卵巢管出現(xiàn)2～3 個不同發(fā)育時期的卵泡，平均每個卵巢管有0.12 粒±0.01 粒卵發(fā)育成熟， 卵巢管寬度快速增加至417.51 μm±24.09 μm；Ⅳ級：羽化后4～5 d，大多卵巢管包含3 個處于不同發(fā)育時期的卵泡， 每個卵巢管平均有0.37 粒±0.02 粒卵發(fā)育成熟，個別個體已有部分卵粒排出，在中輸卵管有待產(chǎn)卵粒，卵巢管寬度增加至565.10 μm±15.12 μm，并保持穩(wěn)定。

2.3 龜紋瓢蟲濾泡上皮細胞及其發(fā)育

2.3.1濾泡上皮細胞形態(tài)學觀察。 采取細胞核、細胞骨架染色法探究了龜紋瓢蟲羽化后第1、3、5天濾泡上皮細胞的動態(tài)變化規(guī)律。 在雌成蟲羽化后第1 天，濾泡上皮細胞為圓形，細胞之間緊密排列，細胞核充滿整個細胞，濾泡上皮細胞之間沒有間隙出現(xiàn) （圖5A～C）。 雌成蟲羽化后第3天，細胞體積變大但仍緊密排列，細胞核依然占據(jù)大部分細胞空間， 細胞形狀由圓形變成多邊形，還未出現(xiàn)卵黃沉積，沒有觀察到孔隙出現(xiàn)（圖5D～F）。 在成蟲羽化后第5 天，細胞體積進一步變大， 由規(guī)則的多邊形變成不規(guī)則的多邊形，細胞排列疏松，細胞間隙變大，能夠明顯觀察到濾泡上皮細胞之間間隙的出現(xiàn)（圖5G～I）。

2.3.2濾泡上皮細胞細胞核和細胞核間距。 羽化后第1 天至第3 天， 雌成蟲濾泡上皮細胞核間距由1.94μm±0.13μm 變?yōu)?.57μm±0.36μm， 細胞核直徑由8.50 μm±0.32 μm 增加到11.06 μm±0.39 μm，細胞排列緊密，細胞核幾乎充滿整個細胞（圖5A～F），表明該時期細胞逐漸增大，但間隙尚未形成。在雌成蟲羽化后第3～5 天發(fā)育過程中，濾泡上皮細胞核間距急劇變大，由第3 天的4.57 μm±0.36 μm 增 大 到16.4 μm±1.05 μm（圖6A），細胞核直徑也由第3 天的11.06 μm±0.39 μm 增加到第5 天的15.76 μm±0.36 μm （圖6B），細胞排列疏松。

3 討論

體型大小是衡量昆蟲繁殖能力、 捕食能力、活動能力和環(huán)境適應能力重要指標之一[12-14]。 本研究對龜紋瓢蟲各發(fā)育階段體長體寬進行測定，龜紋瓢蟲1～4 齡幼蟲， 其中2 齡到3 齡的體長增加最快， 體寬的增長趨勢和體長基本一致，在末齡幼蟲期，體長增加減慢，體寬仍快速增加，積累大量營養(yǎng)物質(zhì)準備化蛹；成蟲體長為5.35 mm±0.07 mm，體寬為3.70 mm±0.05 mm。 總體來說，龜紋瓢蟲成蟲期體長小于植食性瓢蟲平均值（7.2 mm），大于捕食性瓢蟲平均值（4.48 mm）[15]。劉德波[16]對瓢蟲體長、體寬的研究發(fā)現(xiàn)，處在不同海拔、植被和季節(jié)的同種瓢蟲的體長和體寬存在明顯差異。 這說明在相應生理指標的比較研究中需要考慮環(huán)境因素。畢孟杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，瓢蟲的體長、體寬主要受到溫度影響，并且符合貝格曼法則，即體型隨著溫度增加而變大。 耐饑力假說或許對這些現(xiàn)象能夠做出解釋，即體型越大的昆蟲儲存能量越多，越適合在獵物可獲得性減少的環(huán)境中生存[17]。

本研究中，對龜紋瓢蟲不同蟲態(tài)發(fā)育歷期測定結(jié)果顯示，龜紋瓢蟲幼蟲歷期為6.28 d±0.16 d，蛹期平均為2.81 d±0.08 d， 雌成蟲平均歷期為51.08 d±1.13 d， 雄成蟲平均歷期為48.36 d±1.29 d。 這些結(jié)果與陳潔等[18]、程樹蘭等[19]和楊建華[20]報道的基本一致。 龜紋瓢蟲發(fā)育歷期小于陳潔等[21]和周雷等[22]報道的異色瓢蟲和茄二十八星瓢蟲發(fā)育歷期，然而捕食性瓢蟲龜紋瓢蟲的最適生長溫度（25 ℃）與異色瓢蟲相同，而與植食性瓢蟲茄二十八星（31 ℃）存在較大差別。 因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，應考慮創(chuàng)造有利于天敵而不利于害蟲的生存環(huán)境， 從而達到抑制害蟲種群增長的目的。 龜紋瓢蟲成蟲在羽化后第5 天開始產(chǎn)卵，約在第10 天達到產(chǎn)卵高峰，一生平均產(chǎn)卵量為414粒，最高產(chǎn)卵量達到654 粒。這與陳潔等[18]和潘悅等[23]報道的每只雌成蟲平均產(chǎn)卵量749 粒和600粒稍有不同，推測可能與飼喂材料不同或者蟲源地域不同有關(guān)。

龜紋瓢蟲雌成蟲羽化后第2 天在卵巢管卵原區(qū)內(nèi)能觀察卵泡，在第3 天單個卵巢管最多出現(xiàn)2 個不同發(fā)育時期的卵泡， 在第4～5 天卵泡數(shù)最多為3 個。大多數(shù)昆蟲卵巢管有多個卵泡[24]，鱗翅目昆蟲每個卵巢管含有超過100 個卵泡[25]。在羽化后第4 天，龜紋瓢蟲卵巢管開始有成熟卵出現(xiàn)，到第5 天成熟卵比例增加并開始產(chǎn)卵。 這與張麗莉等[11]報道的龜紋瓢蟲產(chǎn)卵時間基本一致。 不同于陳潔等[26]根據(jù)異色瓢蟲中有無卵室以及卵黃沉積情況進行卵巢發(fā)育分級的方式，本研究傾向于依據(jù)具體的發(fā)育參數(shù)進行分級，根據(jù)不同發(fā)育階段特定卵泡數(shù)、發(fā)育成熟卵數(shù)和不同發(fā)育程度卵巢管寬度把卵巢發(fā)育分為4 級。

通過對濾泡上皮細胞細胞核和細胞骨架染色，觀察了不同發(fā)育階段濾泡上皮細胞形態(tài)變化以及濾泡上皮細胞間隙開放動態(tài)，并對其變化原因進行了分析，為進一步探索濾泡上皮細胞間隙開放調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。 保幼激素被證明參與濾泡上皮細胞孔隙開放的調(diào)控，能夠通過蛋白激酶-C 依賴的級聯(lián)反應作用于濾泡細胞， 刺激膜結(jié)合的Na+/K+-ATPase 離子平衡發(fā)生改變， 導致水分流失、細胞收縮，進而調(diào)控濾泡細胞之間孔隙開放[27]。在一些鞘翅目昆蟲中，通過保幼激素激活Na+/K+-ATPase 造成濾泡上皮細胞縮水這種調(diào)控濾泡細胞孔隙開放的機制也被證實[28]。 濾泡上皮細胞不僅調(diào)控卵黃攝取，而且在昆蟲退化的卵室中參與清理周圍死亡的生殖細胞，對有效去除死細胞維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要[29]。

本研究就龜紋瓢蟲的生長發(fā)育、卵發(fā)生與濾泡上皮細胞發(fā)育動態(tài)做了初步研究，加深了對龜紋瓢蟲生物學及生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的認識，為龜紋瓢蟲生殖相關(guān)研究提供了新的基礎(chǔ)信息。 但本研究僅是基于實驗室飼養(yǎng)條件下取食豌豆修尾蚜種群的龜紋瓢蟲，沒能對取食人工飼料的龜紋瓢蟲卵泡、卵和濾泡上皮細胞發(fā)育進行相關(guān)探究。 今后應進行相關(guān)研究，并更深層次探索相關(guān)生殖調(diào)控機制。

4 結(jié)論

以我國棉田瓢蟲優(yōu)勢種龜紋瓢蟲為試蟲，明確其在實驗室中以豌豆修尾蚜為食條件下的相關(guān)生長發(fā)育和生殖發(fā)育參數(shù)，明確了龜紋瓢蟲雌性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)觀察了卵泡、卵和濾泡上皮細胞的發(fā)育過程。 根據(jù)不同發(fā)育階段特定卵泡數(shù)、發(fā)育成熟卵數(shù)和不同發(fā)育程度卵巢管寬度將其卵巢發(fā)育分為4 級；明確了其成蟲羽化后1 d、3 d、5 d 濾泡上皮細胞的形態(tài)變化，并在卵黃沉積期觀察到濾泡上皮細胞之間形成的間隙用于卵母細胞攝取卵黃原蛋白。