超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法研究菊三七總生物堿致肝毒性的血清代謝組學(xué)

林珠燦， 易 開(kāi)， 許 文， 郭素華

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122)

代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化來(lái)研究生物體系的一門科學(xué)[1]。在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用到中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)、毒副作用及作用機(jī)制等研究[2]。近年對(duì)于中藥毒性的代謝組學(xué)研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。針對(duì)中藥的毒性研究，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)也啟動(dòng)了開(kāi)展植物藥安全性和藥物毒性評(píng)價(jià)的代謝組學(xué)計(jì)劃，荷蘭還成立了專門針對(duì)中藥的代謝組學(xué)研究中心[3]。國(guó)內(nèi)已有人報(bào)道了基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF MS)和1H-NMR方法的半夏、關(guān)木通、附子、朱砂、雄黃[4]及甘遂[5]等藥物毒性評(píng)價(jià)的相關(guān)研究。

菊三七又名紅背三七、土三七，為菊科菊三七屬植物菊葉三七(GynurasegetumMerr.)的根或全草，始載于《滇南本草》，其味甘、微苦，性溫，有破血散瘀、止血、消腫之功，主治跌打損傷、創(chuàng)傷出血、吐血、產(chǎn)后血?dú)馔吹劝Y[6]。目前對(duì)菊三七的藥理活性研究較廣，主要集中在止血、抗瘧、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等方面[6]，然而近年因服用菊三七的中毒現(xiàn)象屢有發(fā)生，其所致肝竇阻塞綜合征(Hepatic Sinusoidal Obstruction Syndrome,HSOS)的臨床報(bào)道日益增多[7]，并已引起廣泛關(guān)注。有研究認(rèn)為，菊三七具有嚴(yán)重的肝毒性與其所含的吡咯里西啶類生物堿(Pyrrolizidine Alkaloids,PAs)，如千里光堿、千里光菲靈堿、菊三七堿甲、堿乙及千里光堿-N-氧化物等[6]有關(guān)，但對(duì)其肝毒性機(jī)制的研究尚處于初步階段。代謝組學(xué)可通過(guò)分析與毒性密切相關(guān)的生物體體液或組織中代謝產(chǎn)物隨時(shí)間變化的關(guān)系，可以從“組學(xué)”的角度評(píng)價(jià)中藥的毒性與安全性，但目前尚未見(jiàn)菊三七總生物堿致肝毒性的代謝組學(xué)的研究報(bào)道?；诖耍緦?shí)驗(yàn)采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)的代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合主成分分析(PCA)與偏最小二乘法-判別分析(PLS -DA)等模式，分析菊三七總生物堿給藥前后大鼠血清代謝產(chǎn)物差異，以期尋找潛在的毒性生物標(biāo)記物，從代謝角度探討菊三七總堿致肝毒性的作用機(jī)制，為該藥民間、臨床的合理及安全應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1290 UPLC和AB Sciex Triple TOF MS 6600系統(tǒng)(美國(guó)，Agilent公司)；7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本，日立公司)。

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)由浙江康特生物科技有限公司提供；L-2-氯苯丙氨酸(CAS：103616-89-3，≥98%)購(gòu)自上海恒柏生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為質(zhì)譜級(jí)(德國(guó)默克公司)；其余試劑均為分析純。

菊三七購(gòu)于河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院車蘇容副教授鑒定為菊科菊三七屬植物菊葉三七(GynurasegetumMerr.)的干燥根。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菊三七總生物堿的制備[8]稱取菊三七根800 g，粉碎，用95%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，加200 mL 1%HCl超聲溶解20 min，離心，取上清液，加氨水調(diào)節(jié)pH至11，以二氯甲烷萃取3次，每次200 mL，合并二氯甲烷相，減壓回收至干，即得菊三七總生物堿。

1.2.2動(dòng)物分組與給藥取清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，每只180～220 g(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)，隨機(jī)分成3組，分別標(biāo)記為空白組、菊三七總堿低劑量組和高劑量組。將總堿用5%HCl溶解，加1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6，再加生理鹽水配制成一定濃度[9]。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，低、高劑量組分別灌胃給予19.7、39.5 mg/kg的總堿[9]，空白組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.3血清生化指標(biāo)檢測(cè)各組大鼠每周在灌胃后，1 h眼眶取血，靜置1 h后析出血清，于溫度4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上層血清,置于-80 ℃保存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT、AST及TBIL水平(由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè))。

1.2.4血清處理保存在-80 ℃冰箱的空白組及高劑量組肝毒性大鼠血清，取出復(fù)融后，取100 μL血清樣本，加入300 μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1)，再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，渦旋混勻30 s，冰水浴超聲10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取60 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶中。同時(shí)每個(gè)樣本各取10 μL 混合成質(zhì)控(QC)樣本，再取60 μL上機(jī)待測(cè)。

1.2.5色譜與質(zhì)譜條件[10]色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100×2.1 mm，1.7 μm，Waters)；流動(dòng)相A為水(含有25 mmol/L的乙酸銨及25 mmol/L的氨水)，B為乙腈，梯度洗脫：0～0.5 min，5%A；0.50～7.0 min，5%→35%A；7.0～8.0 min，35%→60%A；8.0～9.0 min，60%A；9.0～9.1 min，60%→5%A；9.1～12.0 min，5%A；進(jìn)樣體積0.5 μL，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，樣品溫度4 ℃。質(zhì)譜條件：AB 6600 Triple TOF MS儀在控制軟件(Analyst TF 1.7，AB Sciex)下基于IDA功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子進(jìn)行采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，15張二級(jí)譜圖/50 ms。ESI離子源參數(shù)如下：霧化氣壓(GS1)：60 Pa，輔助氣壓(GS2)：60 Pa，氣簾氣壓：35 Pa，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負(fù)離子模式)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析運(yùn)用XCMS(版本號(hào)：1.41.0)開(kāi)發(fā)的xcms4dda和xcms4lipid程序及自建庫(kù)，將LC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰的尋找與校準(zhǔn)，minfrac設(shè)為0.5，cutoff設(shè)為0.6。利用每個(gè)樣本的總離子流色譜峰峰面積進(jìn)行歸一化法數(shù)據(jù)處理。將處理好的分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件(V14.1，Sweden)進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(OPLS -DA)。以t檢驗(yàn)(Student’s t-test)的P值(P-value)小于0.05，同時(shí)OPLS -DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in the Projection,VIP)大于1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菊三七總堿對(duì)大鼠血清ALT、AST及TBIL水平的影響

與正常組的大鼠相比，給藥1周后，高劑量組ALT顯著性升高(P<0.01)，低劑量沒(méi)有顯著性差異，AST值則高、低劑量組均有顯著上升(P<0.01)，但TBIL值無(wú)顯著性差異，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥2周后，高、低劑量組的ALT、AST及高劑量組的TBIL水平皆有顯著性升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 菊三七總堿對(duì)大鼠血清ALT、AST 及TBIL的影響

*P<0.05,**P<0.01 compared with the control group.

2.2 大鼠血清代謝輪廓分析

連續(xù)給藥2周后，空白組和高劑量組大鼠血清經(jīng)過(guò)UPLC-Q-TOF MS分析后，得到兩組具有代表性的總離子流(TIC)色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 高劑量組和空白組大鼠血清正、負(fù)離子掃描的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of rat serum samples from the high dose group and control group in positive and negative ion mode a:positive ion mode;b:negative ion mode.

2.3 總堿致肝毒性大鼠血清的PCA分析

對(duì)空白組和高劑量組給藥2周的大鼠血清LC-MS代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在正、負(fù)離子掃描模式下，兩組血清樣本分離顯著。說(shuō)明菊三七總堿致大鼠機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了明顯變化。

2.4 總堿致肝毒性大鼠血清的OPLS -DA分析

為了進(jìn)一步探討總堿引起的血清代謝差異，找到與總堿所致肝毒性相關(guān)的代謝通道變化。以監(jiān)督性O(shè)PLS -DA法對(duì)高劑量組和空白組樣本重新建模。通過(guò)OPLS -DA分析，可以過(guò)濾掉代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對(duì)非正交變量和正交變量分別分析，從而獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實(shí)驗(yàn)組的相關(guān)程度信息。模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證進(jìn)行檢驗(yàn)，用交叉驗(yàn)證后得到的R2Y(模型對(duì)分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測(cè)性)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判。結(jié)果如圖3所示，兩組血清樣本在其中一維得到顯著的區(qū)分,且各組樣本各自集中分布，表明該總堿可能是造成大鼠體內(nèi)代謝紊亂的主要因素。

圖2 高劑量組()對(duì)空白組()的PCA得分散點(diǎn)圖(A為正離子掃描模式：R2Xcum=0.741；B為負(fù)離子掃描模式：R2Xcum=0.714)Fig.2 Principal components analysis(PCA) score plots of metabolic profiling of rat serum samples from the high dose group() and control group () in positive(A:R2Xcum=0.741) and negative ion mode(B:R2Xcum=0.714)

為了驗(yàn)證所建立模型的有效性，運(yùn)用置換檢驗(yàn)通過(guò)隨機(jī)多次改變分類變量Y的排列順序(次數(shù)n=200)以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值，對(duì)OPLS -DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況，原模型可以很好地解釋兩組樣本之間的差異。

圖4 高劑量組對(duì)空白組OPLS -DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果示意圖(A為正離子掃描模式：R2Y(cum)=0，0.57，Q2(cum)=0,-1.31；B為負(fù)離子掃描模式：R2Y(cum)=0,0.57，Q2(cum)=0,-1.25)Fig.4 Permutation test model validation plot of OPLS -DA of the high dose group and control group in positive(A:R2Y(cum)=0，0.57，Q2(cum)=0,-1.31) and negative ion mode(B:R2Y(cum)=0,0.57，Q2(cum)=0,-1.25)

2.5 潛在生物標(biāo)記物的篩選與鑒定

基于高劑量組和空白組大鼠血清樣本的OPLS -DA分析，以同時(shí)滿足t檢驗(yàn)的P<0.05，OPLS -DA模型第一主成分的VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選與總堿致肝毒性高度相關(guān)的差異代謝物。通過(guò)匹配HMDB，KEEG及自建庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù),解析二級(jí)質(zhì)譜,從中篩選鑒定出34個(gè)可能的代謝物，見(jiàn)表2。其中，肌氨酸、肌酐、D-脯氨酸、L-丙氨酸、5-羥吲哚乙酸、吲哚丙烯酸、馬尿酸代謝水平的下調(diào)，酪胺、β-高脯氨酸、L-苯丙氨酸代謝水平的上升，顯示菊三七總堿肝毒性可引發(fā)氨基酸代謝途徑發(fā)生紊亂；丙三醇、尿嘧啶、胞苷、脫氧胞苷、5′-單磷酸胞苷、尿苷、2′-脫氧尿苷、嘌呤、黃嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞苷等代謝水平的變化表明總堿肝毒性可致核苷酸代謝途徑異常；肉豆蔻酸、順-9-棕櫚酸、順-(6，9，12)亞麻酸、亞油酸代謝水平的變化與總堿肝毒性引起脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)；膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z(去氧)膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、甘氨鵝去氧膽酸等代謝水平的上升說(shuō)明菊三七總堿致肝毒性特征是膽汁淤積型，推測(cè)可能由于膽汁不能順利排出，造成膽汁成分反流至血液，因而血清中膽汁酸類成分明顯增高[11]。

*P<0.05,**P<0.01 compared with the control group;avariable importance in the projection.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-Q-TOF MS的血清代謝組學(xué)方法，從整體代謝指紋譜的角度對(duì)菊三七總生物堿致肝毒性潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行了探索性研究，從血清中篩選鑒定出34個(gè)肝毒性高度相關(guān)的差異代謝物，初步闡明了菊三七總堿致肝毒性的作用機(jī)制主要與氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)等代謝途徑及肝腸循環(huán)紊亂相關(guān)，為菊三七總堿肝毒性的作用機(jī)制補(bǔ)充了代謝信息。