基于ITS序列對(duì)河南省山區(qū)部分野生食藥用菌種質(zhì)資源鑒定分析

崔筱 付曉雨 胡素娟 宋志波 劉芹 孔維威 康源春 袁瑞奇 張玉亭 孔維麗

摘 ? ?要：為了對(duì)收集的河南省野生食藥用菌資源開(kāi)展分類鑒定，應(yīng)用ITS（Internal transcribed spacer）序列分析方法對(duì)收集于不同地區(qū)的51株野生食用菌菌株進(jìn)行鑒定，基于NJ（Neighbour-Joining）法構(gòu)建rDNA ITS1、ITS4序列的分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)，同時(shí)對(duì)相同屬間各菌株ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析。 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，51個(gè)菌株的核酸序列相似性在92.9%～100%，隸屬于2個(gè)亞綱5目14科14屬28種;遺傳進(jìn)化樹(shù)分為3個(gè)分支，側(cè)耳屬（Pleurotus）的蓋囊側(cè)耳（Pleurotus cystidiosus）單獨(dú)聚為一支，肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）、哥倫比亞側(cè)耳（Pleurotus columbines）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和美味側(cè)耳（Pleurotus sapidus）聚為第二支，絲膜菌屬（Cortinarius）、馬勃屬（Lycoperdon）、口蘑屬（Tricholoma）、乳牛肝菌屬（Suillus）、靈芝屬（Ganoderma）、乳菇屬（Lactarius）等聚為第三支，種間各自聚為小支，表現(xiàn)出良好的單系性;側(cè)耳屬的25個(gè)菌株為6個(gè)差異菌株，絲膜菌屬、馬勃屬、口蘑屬、乳牛肝菌屬、靈芝屬、乳菇屬等的18株菌株為14個(gè)差異菌株。本研究為深入了解河南省野生資源分布奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生食藥用菌;鑒定分析;ITS

中圖分類號(hào)：S646 ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.07.001

Abstract： To carry out classification and identification of the collected wild edible and medicinal fungi resources in Henan Province，the internal transcribe spacer sequence analysis was used to identify 51 strains of wild edible fungi collected from different regions， a phylogenetic tree of rDNA ITS1/ITS4 sequences was constructed by NJ（Neighbor-joining） method， and the ITS sequence of each strain in the same genus was analyzed.The NCBI blast results showed that the sequence similarity of nucleic acid sequences of 51 strains on NCBI was between 92.9% and 100%， which were belonging to 2 subclasses 5 orders 14 families 14 genera 28 species.The genetic evolution trees showed that the 51 strains were divided into three branches， of which Pleurotus cystidiosus was isolated into one branch， Pleurotus pulmonarius， Pleurotus columbines， Pleurotus ostreatus， and Pleurotus sapidus clustered into the second branch， and Cortinarius， Lycoperdon， Tricholoma， Suillus， Ganoderma， Lactarius etc.clustered into the third branch， and each species aggregated into small branches showing a good monophyletic property.Analysis of the ITS sequences of each strain of the same genus showed that 25 strains of the Pleurotus genus were identified as 6 different strains， and 18 strains of the Cortinarius， Lycoperdon， Tricholoma， Suillus， Ganoderma， Lactarius etc. were identified as 14 different strains. This study could lay a foundation for further understanding of the wild resources distribution in Henan Province.

Key words： wild edible and medicinal fungi; identification analysis; ITS

河南省地域廣闊，位于南暖溫帶與北亞熱帶的過(guò)渡地帶，氣候溫暖，雨量較為充沛，山林茂密，植被類型復(fù)雜，適于各種菌類繁殖生長(zhǎng)，野生資源相當(dāng)豐富。隨著人們生活水平的不斷提高，食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)注度得到提高，許多國(guó)家和地區(qū)對(duì)食用真菌資源狀況進(jìn)行了調(diào)查研究。Pera等[1]采集西班牙北部天然林和人工林中海岸松下的98株菌根真菌，共有35種，隸屬于16屬，均為大型食用真菌，可形成外生菌根，證明了真菌和海岸松之間共生關(guān)系;Rincón等[2]從加泰羅尼亞松林混合林中收集60個(gè)菌株，發(fā)現(xiàn)僅有17個(gè)菌株，隸屬于大型真菌的8個(gè)屬，可形成外生菌根，其中有幾個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的物種，進(jìn)一步證明了真菌和海岸松之間共生關(guān)系;李碧瓊等[3]連續(xù)3年多次對(duì)莆田老鷹尖自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行野外定點(diǎn)調(diào)查，初步發(fā)現(xiàn)該區(qū)擁有22科、95種野生食用菌資源;徐凌川等[4]通過(guò)對(duì)山東省各地大型真菌調(diào)查研究，以拍照和采集子實(shí)體的方法，借助放大鏡、體視顯微鏡、生物顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行性狀和顯微觀察，根據(jù)Ainsworth分類系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)山東省具有食用和藥用價(jià)值的真菌共有255種，隸屬于6綱14目45科113屬;陳光富等[5]通過(guò)對(duì)玉龍雪山云冷杉針葉林內(nèi)野生食用菌資源組成進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有食用菌資源17科21屬37種，22種可食用，15種藥食同性;張根偉等[6]對(duì)承德壩上及其鄰近地區(qū)松林下野生食用菌的資源狀況進(jìn)行了調(diào)查研究，共鑒定標(biāo)本148號(hào)，計(jì)16科31屬102種（含變種、變型）。上述研究均基于形態(tài)學(xué)對(duì)大型食用真菌的鑒定研究，然而，關(guān)于河南省野生食用菌資源的研究，僅申進(jìn)文等[7]、杜敏華等[8]對(duì)伏牛山區(qū)開(kāi)展了部分調(diào)查研究分類，尚沒(méi)有進(jìn)行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。

對(duì)大型真菌分類的常規(guī)鑒定主要是依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)、顏色、氣味以及孢子特征等，這些形態(tài)特征經(jīng)常是易變、模糊且易混淆的，因而依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定總是帶有一定的局限性和主觀性[9]，同時(shí)有些種內(nèi)食用菌外觀特征差異較小，僅憑傳統(tǒng)的形態(tài)特征進(jìn)行分類不能鑒定出其遺傳學(xué)多態(tài)性。真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer ITS），又叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是位于真菌核糖體DNA（rDNA）上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2），其兩側(cè)分別是18S RNA基因和28S RNA基因[10]。因其序列種間變異度高，在物種和亞種水平上的識(shí)別信息最為豐富[11]且在測(cè)序錯(cuò)誤及假基因出現(xiàn)的情況下保持高準(zhǔn)確度[12]，因此可作為物種新的可識(shí)別特征之一，為分類和精確識(shí)別奠定基礎(chǔ)[13-14]。因此，本研究采用ITS法對(duì)近幾年河南省豫西南、豫北、豫南等各地采集分離的部分野生食用菌進(jìn)行鑒定，以期對(duì)野生食用菌種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 收集保藏的51株野生食用菌菌株（表1）樣品采集于三門(mén)峽、新鄉(xiāng)、信陽(yáng)等地，現(xiàn)保存于“河南省食用菌種質(zhì)資源庫(kù)”。

1.1.2 主要試劑及引物 Taq PCR Master Mix聚合酶、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑及4sGelRed染液均購(gòu)自上海生工有限公司;pMD-18T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;rDNA ITS 分析所用的ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)樣品快速研磨儀JXFSTPRP-64（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），微波爐G8023CTL-K3（佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司），干式恒溫器DB10（杭州茂豐儀器有限公司），電子天平JA2003N（上海佑科儀器儀表有限公司），小型離心機(jī)3K15（德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)有限公司），EPS 300 電泳儀（上海郎賦實(shí)業(yè)有限公司），全自動(dòng)凝膠成像分析儀JS-680D（上海培清科技有限公司），恒溫磁力攪拌器85-2（常州智博瑞儀器制造有限公司），酸度計(jì)PHS-3E（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生食藥用菌的采集 2020年9月，對(duì)河南省主要山區(qū)（大別山、伏牛山、太行山）及周邊地區(qū)進(jìn)行樣品采集并拍照并進(jìn)行編號(hào)，記錄觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.2.2 DNA提取 將51株食用菌菌株的子實(shí)體置于1.5 mL無(wú)菌離心管中，于全自動(dòng)快速研磨儀中研磨成粉提取各樣品的基因組DNA，基因組DNA提取方法采用微波爐法[16]，1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和濃度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，Taq PCR Master Mix聚合酶12.5 μL，上下游引物（10 μmol· L-1）各1 μL，超純水4.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，30 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序 擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取5 μL 的PCR產(chǎn)物與 1μL 4sGelRed染液混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，全自動(dòng)凝膠成像分析儀JS-680D下檢測(cè)擴(kuò)增條帶?；厥照_的擴(kuò)增條帶（500～800 bp）連于pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，菌落PCR法驗(yàn)證單克隆大腸桿菌菌株，將驗(yàn)證正確的大腸桿菌菌株送華大基因測(cè)序。

1.2.5 同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 測(cè)序獲得的序列經(jīng)DNAMAN軟件多序列比對(duì)重排后，于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上比對(duì)，MEGA-X軟件構(gòu)建同種菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

共采集51株野生食用菌（圖1），根據(jù)其形態(tài)特征，結(jié)合查閱中國(guó)大型菌物資源圖鑒[15]鑒定標(biāo)本51株，51個(gè)菌株隸屬于2個(gè)亞綱5個(gè)目14個(gè)科14個(gè)屬（表2），表現(xiàn)出了較高的資源豐富度。部分標(biāo)本形態(tài)學(xué)鑒定如下：編號(hào)20LD014、20LD015大型真菌菌蓋直徑5～10 cm，發(fā)生在三門(mén)峽市盧氏縣大溝山的針闊混交林地上，菌肉淡黃色至黃色，菌柄長(zhǎng)5～10 cm，圓柱形，基部有暗褐色硬毛，初步鑒定為牛肝菌目的物種;編號(hào)20XS001大型真菌發(fā)生在信陽(yáng)市浉河區(qū)一塊腐朽木頭上，菌蓋半圓形，表面顏色淡黃色至藍(lán)灰色，邊緣銳，菌肉乳白色，初步鑒定為多孔菌目的物種;編號(hào)20XH002大型真菌發(fā)生在輝縣市棗樹(shù)溝一塊腐木上，菌蓋扇形，菌肉木栓質(zhì)，邊緣薄，全緣，具漆樣光澤，菌管多層，分層不明顯，初步鑒定為多孔菌目靈芝科靈芝屬的物種;編號(hào)20LD009大型真菌發(fā)生在三門(mén)峽市盧氏縣大溝山的闊葉林中地上，子實(shí)體高3～8 cm，近球形，表面覆蓋疣狀和錐形突起，脫落后在表面形成淡色圓點(diǎn)，連接成網(wǎng)紋，初步鑒定為蘑菇科馬勃屬的物種;編號(hào)20XH005大型真菌發(fā)生在輝縣市轎頂山景區(qū)針葉林中落葉層上，子實(shí)體高5～7.5 cm，黃色，整體近球形至倒圓錐形，主支長(zhǎng)1～4 cm，分支3～5回，初步鑒定為枝瑚菌屬的物種。

2.2 rDNA ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增

51株野生食用菌菌株的rDNA ITS 區(qū)段 PCR擴(kuò)增均得到了目的條帶，經(jīng)檢測(cè)，擴(kuò)增條帶在500～800 bp之間，符合測(cè)序要求。

2.3 測(cè)序及NCBI比對(duì)結(jié)果

Renske等[18]提出，供試的rDNA ITS序列通過(guò)與NCBI的 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，序列相似性為95%～99%，鑒別為相同屬;序列相似性≤95%，鑒別為相同科。將經(jīng)檢驗(yàn)條帶正確的陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序后，得到的rDNA ITS序列在GeneBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到與其最相似的物種名、登記號(hào)及相似率，結(jié)果表明，51個(gè)菌株核酸序列在NCBI上的序列相似性在92.9%～100%之間（表3），序列相似性≥99%的有42個(gè)菌株，序列相似性為95%～99%的有8個(gè)菌株，序列相似性≤95%的有1個(gè)菌株。

2.4 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序得到的rDNA ITS1序列經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)重排后，MAGA X軟件基于NJ法構(gòu)建51株野生菌株的rDNA ITS1序列的分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)（圖2）。由圖2可知，整個(gè)進(jìn)化樹(shù)的51個(gè)菌株分為3個(gè)分支。側(cè)耳屬（Pleurotus）蓋囊側(cè)耳（P. cystidiosus）菌株編號(hào)37、40、42、43、44聚為一支，分支中菌株編號(hào)37、43為一組，其自展支持強(qiáng)度為58;菌株編號(hào)40、42、44組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為60。側(cè)耳屬肺形側(cè)耳（P. pulmonarius）、哥倫比亞側(cè)耳（P. columbines）、糙皮側(cè)耳（P. ostreatus）和美味側(cè)耳（P. sapidus）聚為第二支，其中美味側(cè)耳、哥倫比亞側(cè)耳和糙皮側(cè)耳聚為一個(gè)類群，除菌株編號(hào)21肺形側(cè)耳外，其他肺形側(cè)耳菌株單獨(dú)聚為一個(gè)類群，菌株編號(hào)33、34、35、36、50聚為一組，菌株編號(hào)22、23、24、26、27、28、29、30、31、47、49聚為一組，菌株編號(hào)21、25、32、48分別各自為一組。絲膜菌屬（Cortinarius）、馬勃屬（Lycoperdon）、口蘑屬（Tricholoma）、乳牛肝菌屬（Suillus）、靈芝屬（Ganoderma）、乳菇屬（Lactarius）、栓孔菌屬（Trametes）、叢枝菌屬（Ramaria）等聚為第三支，絲膜菌屬的菌株編號(hào)2、17和18聚為一組，組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為92;馬勃屬的8、9和10三個(gè)菌株組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為100;口蘑屬的兩個(gè)菌株13和20組成姐妹群，其自展支持強(qiáng)度為100;靈芝屬的兩個(gè)菌株38和39及栓孔菌屬的1個(gè)菌株45組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為94;乳菇屬的三個(gè)菌株4、5和7與叢枝菌屬的菌株（菌株41）聚為一組;乳牛肝菌屬的三個(gè)菌株6、14和15聚為一組，組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為100;Rhodocollybia butyracea菌株1、Tricholoma sulphurescens菌株3、Armillaria gallica菌株11、Tricholoma bakamatsutake菌株12、Lepista nuda菌株16、Amanita citrine菌株19、Psathyrella SP.菌株46、Volvariella bombyvina菌株51各自單獨(dú)聚為一組。2.5 屬間各菌株ITS序列比對(duì)分析

2.5.1側(cè)耳屬ITS序列比對(duì)分析 將經(jīng)測(cè)序的側(cè)耳屬的25個(gè)株菌株之間進(jìn)一步進(jìn)行ITS序列比對(duì)分析（表未提供），通過(guò)表型與ITS測(cè)序相結(jié)合的方法，將菌株間序列相似性≥99.9%的定義為同一菌株，序列相似性99.0%～99.9%之間的定義為同一亞種。結(jié)果表明，菌株37和43序列相似性99.9%為同一菌株，菌株42和44序列相似性100%為同一菌株，菌株蓋囊側(cè)耳40與43、37、42、44序列相似性99.3%～99.8%，認(rèn)定為同一亞種，表型上同為蓋囊側(cè)耳，與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析一致。同理分析結(jié)果表明，菌株21與其他菌株間的序列差異性在96.1%～96.5%之間，可認(rèn)為肺形側(cè)耳的13個(gè)菌株為2個(gè)不同菌株，22、23、24、26、27、28、29、30、31、47、48和49菌株序列相似性在99.1%～99.9%之間，可認(rèn)為是肺形側(cè)耳的不同亞種，此結(jié)果與圖2肺形側(cè)耳菌株21與其余菌株來(lái)源于不同祖先而分為兩支的結(jié)果一致，此結(jié)果與表型結(jié)果基本一致;美味側(cè)耳菌株36和50與哥倫比亞側(cè)耳菌株32、33和35及糙皮側(cè)耳菌株34間的序列相似性為在99.4%～99.9%之間，可認(rèn)為是同一菌株的不同亞種，由圖2可知，菌株33、34、35、36和50之間為姐妹群，且與菌株32之間可能存在共同祖先。哥倫比亞側(cè)耳菌株25、32、33和35間的序列相似性在99.6%～100.0%，可認(rèn)為是同一菌株。肺形側(cè)耳菌株21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、47、48和49間的序列相似性在96.1%～100.0%，糙皮側(cè)耳菌株34與其他24株菌株間序列差異性在81.0%～99.7%，其中與美味側(cè)耳菌株36和50及哥倫比亞側(cè)耳菌株25，32，33和35間的序列差異性在99.4%～99.7%之間，可認(rèn)為是同一菌株;與肺形側(cè)耳菌株21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、47、48和49間序列差異性在96.9%～98.9%之間;與蓋囊側(cè)耳菌株37、40、42、43和44間序列差異性在80.9%～81.2%之間，且由圖2可知，肺形側(cè)耳與哥倫比亞側(cè)耳菌株25及肺形側(cè)耳、蓋囊側(cè)耳聚在不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)ITS序列比對(duì)分析，側(cè)耳屬的25株菌株被確定為6株菌株，分別為蓋囊側(cè)耳、美味側(cè)耳、哥倫比亞側(cè)耳、肺形側(cè)耳（菌株21）、肺形側(cè)耳（菌株22、23、24、26、27、28、29、30、31、47、48和49）、糙皮側(cè)耳，此鑒定結(jié)果與表型結(jié)果基本一致。

2.5.2絲膜菌屬、馬勃屬、口蘑屬、乳牛肝菌屬、靈芝屬、乳菇屬ITS序列比對(duì)分析 將經(jīng)測(cè)序的絲膜菌屬、馬勃屬、口蘑屬、乳牛肝菌屬、靈芝屬、乳菇屬的18株菌株進(jìn)一步進(jìn)行ITS序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，絲膜菌屬的菌株2、17和18間的序列相似性分別為83.71%（菌株2和17），83.71%（菌株2和18），89.28%（菌株17和18），可認(rèn)為分別為3種菌株，由圖2可知，菌株17與18為姐妹群且與菌株2可能來(lái)源于共同的祖先;馬勃屬菌株8、9和10間的序列相似性分別為96.76%（菌株8和9），98.92%（菌株8和10），96.89%（菌株9和10），可認(rèn)為分別為3種菌株，其中菌株9與10為姐妹群且與菌株8可能來(lái)源于共同的祖先（圖2）;口蘑屬的菌株3、12、13和20）間的序列相似性分別為73.89%（菌株3和12），80.28%（菌株3和13），80.70%（菌株3和20），77.11%（菌株12和13），77.53%（菌株12和20），99.57%（菌株13和20），可認(rèn)為分別為3株菌株，由圖2可知，菌株3和12各自獨(dú)立成支，與菌株13和20親緣關(guān)系較遠(yuǎn);乳牛肝菌屬的菌株6、14和15間的序列相似性分別為99.42%（菌株6和14），99.42%（菌株6和15），99.14%（菌株14和15），可認(rèn)為1種菌株，且菌株6與15為姐妹群與菌株14有共同祖先（圖2）;靈芝屬的菌株38和39為姐妹群，之間的序列相似性分別為99.53%，可認(rèn)為是1種菌株且可能與菌株45來(lái)源于共同祖先（圖2）;乳菇屬的菌株4、5和7間的序列相似性分別為80.13%（菌株4和5），80.35%（菌株4和7），91.20%（菌株5和7），其中菌株5與7為姐妹群，與菌株4可能起源于共同祖先（圖2），可認(rèn)為是3種菌株。絲膜菌屬、馬勃屬、口蘑屬、乳牛肝菌屬、靈芝屬、乳菇屬的18株菌株可最終確定為14株菌株。

3 結(jié)論與討論

ITS序列分析表明51個(gè)野生菌株隸屬于2個(gè)亞綱5個(gè)目14個(gè)科14個(gè)屬的28個(gè)種。分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)將51個(gè)菌株分為3個(gè)大支，側(cè)耳屬（Pleurotus）的蓋囊側(cè)耳（Pleurotus cystidiosus）單獨(dú)聚為一支，肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）、哥倫比亞側(cè)耳（Pleurotus columbines）和糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）等聚為第二支，絲膜菌屬（Cortinarius）、馬勃屬（Lycoperdon）、口蘑屬（Tricholoma）、乳牛肝菌屬（Suillus）、靈芝屬（Ganoderma）、乳菇屬（Lactarius）等聚為第三支，包含了鬼筆亞綱（Phallomycetidae）的紅菇目（Russulales）、針菇目（Gomphales）和多孔菌目（Polyporales） 3個(gè)目，蘑菇亞綱（Basidiomycetidae）傘菌目（Agaricales）中的鵝膏屬（Amanita）、小脆柄菇屬（Lyophyllum）、蜜環(huán)菌屬（Armillaria）、粉金錢(qián)菌屬（Rhodocollybia）、口蘑屬（Tricholoma）、香蘑屬（Lepista）、馬勃屬（Lycoperdon）、絲膜菌屬（Cortinarius）8個(gè)屬。糙皮側(cè)耳（P. ostreatus）與美味側(cè)耳（P. sapidus）菌株和哥倫比亞側(cè)耳（P. columbines）間的序列相似性在99.4%～99.7%之間，與肺形側(cè)耳（P. pulmonarius）菌株間序列相似性在96.9%～98.9%之間，與蓋囊側(cè)耳（P. cystidiosus）5個(gè)菌株間序列相似性在80.9%～81.2%之間，根據(jù)Renske等[18]提出的觀點(diǎn)，側(cè)耳屬的25株菌株被確定為6株菌株，分別為蓋囊側(cè)耳、美味側(cè)耳、哥倫比亞側(cè)耳、2株肺形側(cè)耳（菌株21和菌株23）、糙皮側(cè)耳;絲膜菌屬的3株菌株間的序列相似性<90%，鑒定為差異菌株;馬勃屬3株菌株間的序列相似性<99%，鑒定為3種菌株;口蘑屬的4株菌株鑒定為3株菌株;乳牛肝菌屬的3株菌株相似性大于99%鑒定為同1種菌株;靈芝屬的2個(gè)菌株鑒定為1種菌株;乳菇屬的3株菌株間鑒定為3種菌株，因此51株菌株鑒定為28個(gè)差異菌株。因此該方法可以作為野生資源的分子鑒定及系統(tǒng)地位分類的研究手段之一[19]，同時(shí)該方法還可以可有效的鑒定出食用菌不同屬間及同屬不同種之間的物種的真實(shí)性，已經(jīng)在羊肚菌屬物種[20]的鑒定及54個(gè)栽培平菇種間鑒定進(jìn)行應(yīng)用[21]。

通過(guò)該方法可以確定不同屬間的親緣差異程度，糙皮側(cè)耳與蓋囊側(cè)耳菌株間序列差異性較大（相似性在80.9%～81.2%之間），而與美味側(cè)耳菌株和哥倫比亞側(cè)耳間的序列差異性較?。ㄏ嗨菩栽?9.4%～99.7%之間），而遠(yuǎn)緣雜交就是把不同種屬的物種進(jìn)行雜交，有的甚至?xí)延H緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種做以雜交，從而獲得類型多樣、特性豐富的新種質(zhì)或變異[22]。該研究可以糙皮側(cè)耳（菌株34）和蓋囊側(cè)耳（菌株37、40、42、43和44）任一菌株為親本材料進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，為后續(xù)研究糙皮側(cè)耳與蓋囊側(cè)耳遠(yuǎn)緣雜交提供了理論依據(jù)。因野生資源具有抗逆性強(qiáng)的特性，可將已經(jīng)得到人工種植的菌類，如糙皮側(cè)耳、蓋囊側(cè)耳、口蘑屬、Volvariella bombycina、Ganoderma lucidum等進(jìn)行野生馴化，得到性狀優(yōu)良的可栽培菌株，豐富現(xiàn)有可食用食用菌種類;未經(jīng)人工栽培的野生菌株，如Suillus luteus、Ramaria abietina、馬勃屬等，可作為遺傳種質(zhì)材料，開(kāi)發(fā)利用其功能基因，也可直接作為研究材料，研究其生理生化特性、開(kāi)發(fā)利用其有效功能成分。

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