不同方法檢測(cè)食源性致病菌的對(duì)比研究

蘇敏

摘 要：目的：對(duì)比研究細(xì)菌培養(yǎng)法和熒光PCR法在食源性致病菌檢測(cè)中的效果。方法：選取時(shí)間為2020年6—12月，選取250份樣本進(jìn)行常見(jiàn)食源性致病菌的培養(yǎng)，再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，分別比較不同檢測(cè)方法的結(jié)果。結(jié)果：細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率為18.80%與熒光定量陽(yáng)性率20.0%互比差異微小（χ2=0.890），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：兩種檢測(cè)方法在食源性致病菌檢測(cè)當(dāng)中均具有一定應(yīng)用價(jià)值，但是熒光PCR的優(yōu)勢(shì)（時(shí)限、結(jié)果、效率）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌培養(yǎng)，更加適合應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)當(dāng)中。

關(guān)鍵詞：食源性致病菌;食品安全;細(xì)菌培養(yǎng);熒光PCR檢測(cè)

隨著人們生活水平的不斷提升，人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注度也越來(lái)越高，食品安全問(wèn)題也是全球共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中食源性致病菌是最大的威脅，為此要采用高效的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)食源性致病菌，才能保障食品安全。在食品安全事件當(dāng)中，最為常見(jiàn)的食源性致病菌有副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等，當(dāng)前我國(guó)將細(xì)菌培養(yǎng)法運(yùn)用至食物病原菌的檢測(cè)當(dāng)中，但是由于操作步驟煩瑣、用時(shí)長(zhǎng)等，很難滿足當(dāng)前公共衛(wèi)生事件快速反應(yīng)的需求[1]，為此，檢測(cè)方法必須符合特異性高、靈敏度高、快速等要求，而熒光PCR法作為食源性致病菌的檢測(cè)方式，得到了廣泛的運(yùn)用?；诖耍瑸榱诉x擇更加有效的食源性致病菌檢測(cè)方法，本文分別比較了細(xì)菌培養(yǎng)法以及熒光定量RCR法的檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光定量PCR儀（型號(hào)：ABI7500），美國(guó)ABI公司;檢測(cè)用試劑，均由青島海默技術(shù)有限公司提供;API鑒定生化試條，法國(guó)梅里埃公司;熒光PCR檢測(cè)試劑、樣本處理DNA提取液，均由上海之江生物科技有限公司提供。

1.2 樣本來(lái)源

選取時(shí)間為2020年6—12月，選取250份樣本，包括即食非發(fā)酵豆制品（50份）、速凍熟制米面制品（50份）、熟肉制品（50份）、生禽肉（50份）和生畜肉（50份）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

對(duì)食品樣本中的副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范（第3版）》[2]中的操作流程，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離操作、培養(yǎng)以及鑒定。

1.3.2 熒光PCR檢測(cè)

（1）制備菌株基因組DNA。選擇每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)菌落，采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒，嚴(yán)格按照其說(shuō)明書的內(nèi)容提取每個(gè)菌種的基因組DNA并保存（-20 ℃），將其作為陽(yáng)性對(duì)照。

（2）樣本處理和DNA提取。在無(wú)菌的環(huán)境下，選取食品樣本25.0 g，將其放入無(wú)菌培養(yǎng)基（225 mL）中，增菌24 h（37 ℃），提取增菌液的（50 mL）DNA，采用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

（3）PCR擴(kuò)增。選擇食品樣本中的DNA以及標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板，應(yīng)用特異性引物、探針實(shí)施PCR擴(kuò)增。體系（25 ?L）包括標(biāo)本DNA提取物5 ?L+混合酶0.5 ?L（UNG酶+Taq酶）+PCR反應(yīng)液19.5 ?L。UNG處理時(shí)間為2 min（50 ℃反應(yīng)條件下）;預(yù)變性95 ℃，時(shí)間為3 min;95 ℃，時(shí)間為5 s;55 ℃時(shí)間為60 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

1.4 陽(yáng)性判定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)有效，Ct≤30，且存在明顯指數(shù)增長(zhǎng)期判定為陽(yáng)性;Ct值>35或者無(wú)Ct值，則為陰性。當(dāng)Ct值在30～35，應(yīng)即刻重復(fù)檢驗(yàn)。當(dāng)Ct值在30～35，且存在較為明顯的指數(shù)長(zhǎng)期增長(zhǎng)，判定為陽(yáng)性[3]，反之為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0展開(kāi)詳細(xì)分析，數(shù)量數(shù)據(jù)采用（%）體現(xiàn)，χ2互比檢驗(yàn)，如P值<0.05，則表示為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)結(jié)果

本次選取的實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)物靈敏度是4.9×102 CFU/mL，而選用的DNA檢測(cè)靈敏度為0.1 pg，從樣本中采用細(xì)菌培養(yǎng)共檢出副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌等常見(jiàn)致病菌，分別為9株、13株、10株、15株，共計(jì)47株，細(xì)菌培養(yǎng)總檢出率為18.80%。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)和細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率比較

細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率（18.80%）與熒光定量陽(yáng)性率（20.0%）互比差異微小χ2=0.890，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.3 討論

食品安全已然是全世界的公共衛(wèi)生問(wèn)題，而因?yàn)槭称钒踩珕?wèn)題導(dǎo)致的食源性疾病已得到全社會(huì)的關(guān)注，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[4]，每年因微生物所引發(fā)的食源性疾病占所有疾病的80%，在此嚴(yán)峻的背景之下，我國(guó)衛(wèi)生部早在2 000年已經(jīng)建立了食源性疾病、污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)，然而對(duì)食品樣品的食源性致病菌檢測(cè)主要還是沿用血清學(xué)、生化學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)等，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)，且具有較低的靈敏度，為此已然不適應(yīng)當(dāng)前突發(fā)事件的食品安全保障工作。伴隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)水平的不斷提升，PCR得到了眾多研究者的認(rèn)可，其中熒光PCR檢測(cè)所具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速有效的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于各種病毒、致病菌的檢測(cè)當(dāng)中，為此熒光定量PCR檢測(cè)已經(jīng)成為當(dāng)下微生物學(xué)檢測(cè)最有利的工具。

細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)作為傳統(tǒng)檢驗(yàn)食源性致病菌的技術(shù)，其檢測(cè)原理是通過(guò)對(duì)食品樣本內(nèi)的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，再劃線分離，實(shí)施選擇性培養(yǎng)，觀察菌落的特征，最后鑒別致病菌的種類[5]。由于生物技術(shù)的不斷發(fā)展，顯色培養(yǎng)基因其具有較強(qiáng)的特異性、極高的靈敏度，已經(jīng)被應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)當(dāng)中，有效地提升了檢測(cè)效率。借助微生物鑒定系統(tǒng)能夠有效減少檢測(cè)步驟、縮短檢測(cè)時(shí)間，也能保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中操作流程煩瑣，檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)，不能滿足當(dāng)前的檢測(cè)需求。

PCR檢測(cè)技術(shù)充分運(yùn)用了每類生物所具有的核酸片段特異性，通過(guò)含有放射性同位素探針的補(bǔ)體核酸片段進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)沙門氏菌中效果突出，檢測(cè)中操作步驟簡(jiǎn)單易行、檢測(cè)時(shí)間短，其結(jié)果準(zhǔn)確性高，不僅廣泛地應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)當(dāng)中，也被其他領(lǐng)域所運(yùn)用，為此逐漸延伸出電化學(xué)發(fā)光PCR檢測(cè)技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)等，并且已經(jīng)成為了檢測(cè)食源性致病菌的標(biāo)準(zhǔn)。其中熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)就是本次研究的方法之一。

本次的研究發(fā)現(xiàn)：①食源性致病菌的檢測(cè)是控制和預(yù)防食源性疾病最重要的一環(huán)，雖然我國(guó)已經(jīng)制定了食物中毒病原檢測(cè)方法——細(xì)菌培養(yǎng)，但是眾多缺點(diǎn)很難滿足公共衛(wèi)生事件快速反應(yīng)需求;②本次食源性致病菌樣本較多，為此細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)從檢驗(yàn)、培養(yǎng)基制備、樣品增菌前處理、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)到鑒定整個(gè)過(guò)程需要5～6 d的時(shí)間，且檢測(cè)的結(jié)果非常容易受到多種因素的影響，例如檢驗(yàn)技術(shù)、生化鑒定技術(shù)、培養(yǎng)基質(zhì)量等，且手工分離培養(yǎng)鑒定過(guò)程中，檢出率在一定程度上存在誤差，因此細(xì)菌培養(yǎng)在食源性致病菌檢測(cè)當(dāng)中具有一定的局限性[6];③經(jīng)過(guò)眾多研究者的證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的重現(xiàn)性佳、準(zhǔn)確性高，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用至病原體、基因表達(dá)各個(gè)領(lǐng)域，其操作簡(jiǎn)單、快速、特異性、靈敏度的優(yōu)勢(shì)有效地提升了檢測(cè)工作效率，能夠?qū)崿F(xiàn)和滿足病原微生物快速高通量的檢測(cè)需求，但實(shí)際應(yīng)用中依然存在弊端。由于PCR檢測(cè)為核酸，樣品中的細(xì)胞無(wú)論是死亡亦是存活，都能夠擴(kuò)增出核酸片段，為此可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。由于整個(gè)檢驗(yàn)僅需9 h左右，有效地提升了檢測(cè)效率，更為細(xì)菌分離培養(yǎng)提供了初步信息，同時(shí)提供了實(shí)驗(yàn)室在分離培養(yǎng)操作中的考慮方向，并縮短了分離培養(yǎng)煩瑣的過(guò)程。更為重要的是由于致病菌核酸試劑盒的條件一致，亦能將同一份樣本在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行多種檢測(cè)，故優(yōu)勢(shì)更為突出。

總之，在檢測(cè)食源性致病菌當(dāng)中的技術(shù)眾多，每種技術(shù)均具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，必要時(shí)聯(lián)合多種檢測(cè)手段，以此來(lái)提升食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而保障食品安全[7]。

3 結(jié)論

通過(guò)本次研究結(jié)果顯示來(lái)看，細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率（18.80%）與熒光定量陽(yáng)性率（20.0%）互比差異微小χ2=0.890，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05，充分證明兩種檢測(cè)方法在食源性致病菌檢測(cè)當(dāng)中均具有一定應(yīng)用價(jià)值，但是熒光PCR的優(yōu)勢(shì)時(shí)限、結(jié)果、效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌培養(yǎng)，更加適合應(yīng)用與食源性致病菌的檢測(cè)當(dāng)中。綜上所述，熒光PCR法應(yīng)用在食源性致病菌檢測(cè)當(dāng)中，可提升檢出率、縮短檢測(cè)用時(shí)、提高檢測(cè)效率，故值得借鑒和推廣。

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