生姜蛋白酶基因的克隆及在原核細(xì)胞中的表達(dá)

盧瑛

摘 要：提取萊蕪生姜總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出生姜蛋白酶（Ginger protease）基因GP2和GP3，經(jīng)序列比對，發(fā)現(xiàn)萊蕪生姜蛋白酶基因GP2在945位的堿基與Gene bank中生姜蛋白酶的序列GP2b（GI：57118006）有差異，GP3在451、700和804這3個位置的堿基與GP3b（GI：57118011）有差異，在翻譯后的氨基酸也不同，表明了不同生姜品種生姜蛋白酶基因的多樣性。將克隆的GP2片段GPII重組到帶有His-tag的原核表達(dá)載體pET30a（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-GPII。將重組pET-GPII轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中構(gòu)建工程菌株，工程菌株用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)6 h，IPTG濃度為0.1 mmol/L時，重組GPII表達(dá)量最高。SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明蛋白大小約為21 kDa。該實驗結(jié)果表明生姜蛋白酶能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大量表達(dá)，為生姜蛋白酶工程化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：萊蕪生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核細(xì)胞;表達(dá)

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain，EC 3.4.22.67）是存在于生姜塊狀根莖中的一種巰基蛋白酶，有兩種GP-I和GP-II（GPI和GPII分別與GenBank中GP3和GP2同源性較高），均含有221個氨基酸，含有6個Cys形成3個二硫鍵為糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能夠水解膠原蛋白，可用于肉類嫩化、酒類澄清，乳制品凝固等[1]，以姜汁為添加劑開發(fā)的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在廣東地區(qū)頗受歡迎，因此該酶具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景[2]。

生姜蛋白酶的分離純化工藝操作復(fù)雜，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品種、不同栽培地區(qū)及不同氣候條件下差異非常大，甚至同一品種的干姜與生姜之間的含量也不相同，導(dǎo)致生姜蛋白酶的提取率不穩(wěn)定[3]。尤其生姜常年連作導(dǎo)致莖腐病、斑點病和姜瘟病高發(fā)，推升了市場上生姜的價格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，進(jìn)一步限制了生姜蛋白酶的開發(fā)利用。

本實驗從萊蕪生姜中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增生姜蛋白酶基因，并構(gòu)建了pET-GPII原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了原核表達(dá)，為生姜蛋白酶工程化生產(chǎn)進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和植物材料

大腸桿菌DHB4和宿主菌BL21以及質(zhì)粒pET30a（+）為本實驗室保存，萊蕪生姜購于萊蕪大潤發(fā)超市。

1.1.2 酶、試劑盒和生化試劑

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司;T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit購自ThermoFisher公司;DNA凝膠回收試劑盒和DNA質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MGEA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜蛋白酶cDNA的合成

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒操作說明分離提取生姜總RNA，將RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并稀釋至50 ng/?L。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)Gen Bank（NCBI）數(shù)據(jù)庫中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI：57118005）和GP3a（GI：57118009）的上下游序列設(shè)計特異性引物，以生姜mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，PCR克隆生姜蛋白酶基因。兩對特異性引物，分別為GP2a上游引物：5-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3，下游引物：5-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3;GP3a上游引物：5-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3，下游引物：5-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3;GPII上游引物：5-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3，下游引物：5-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3。

1.2.3 生姜蛋白酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以稀釋后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增生姜蛋白酶基因。PCR反應(yīng)程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶說明書執(zhí)行。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物交由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，并與Gene Bank上已發(fā)布的序列進(jìn)行比對。以GP2序列為模板克隆GPII片段，并連接到表達(dá)載體pET30a（+）載體上轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHB4，經(jīng)Kan+抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選。挑取抗性重組子測序，將序列正確的克隆命名為pET-GPII。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4 生姜蛋白酶表達(dá)條件優(yōu)化

將攜帶重組表達(dá)載體pET-GPII的工程菌BL21在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD600為0.4時，分別加入0～0.5 mmol/L不同濃度的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h，并通過SDS電泳分析IPTG濃度對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。進(jìn)一步在加入0.1 mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)0～10 h不等的時間，分析不同誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)結(jié)果的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜蛋白酶基因的克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過RT-PCR成功獲得與目的基因大小相符的DNA片段。將該片段連接到原核表達(dá)載體pET-30a（+）并進(jìn)行測序，GP2序列全長為1 146 bp，GP3為1 401 bp。序列比對發(fā)現(xiàn)與GP2與GP2b（GI：57118006）同源性為99.91%，僅在945位堿基發(fā)生改變，與GP2a（GI：57118005）相同位置的堿基一致。GP3與GP3b（GI：57118011）同源性為94.77%，有451、700和804這3個位置的堿基發(fā)生改變，與GP3a（GI：57118009）相同位置上的堿基一樣（如圖1所示），說明了不同品種生姜蛋白酶基因的多樣性。進(jìn)一步以GP2為模板，克隆出了726 bp的GPII片段[4]，并將其連接到原核表達(dá)載體pET-30a（+）構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-GPII。

2.2 生姜蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將重組表達(dá)載體pET-GPII轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，培養(yǎng)單克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，濃度為0.05 mmol/L，發(fā)酵1 h，4 h，6 h和10 h，以未添加IPTG的pET-GPII的菌和轉(zhuǎn)化空載體的菌為對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)時間達(dá)到6 h以后，目的基因的蛋白表達(dá)量沒有顯著變化（圖2A）。當(dāng)加入不同濃度的IPTG時，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量最多（圖2B）;因此推斷最佳誘導(dǎo)條件為37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG誘導(dǎo)6 h。

3 結(jié)論與討論

近年來隨著對生姜蛋白酶的深入研究，發(fā)現(xiàn)生姜蛋白酶對肉類具有良好的嫩化作用，對于酒類的澄清效率遠(yuǎn)高于木瓜蛋白酶，還可作為凝乳劑來制作風(fēng)味乳品。用生姜蛋白酶制備的奶酪，口感好，無苦澀感[5-6]，說明生姜蛋白酶具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價值。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰，細(xì)胞生長周期短，增殖速度快，發(fā)酵產(chǎn)量高，易于工程化等優(yōu)點而受到歡迎，而且優(yōu)化發(fā)酵條件可以使目的蛋白以可溶的形式生產(chǎn)。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá)，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)6 h產(chǎn)量最高。這為生姜蛋白酶工程化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]馮敏，唐春紅.生姜蛋白酶的研究概述[J].中國食品添加劑，2008（6）：58-60.

[2]李田葉，李旻，安建樂，等.響應(yīng)面法優(yōu)化生姜蛋白酶提取及酸奶中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2015，36（7）：91-95.

[3]代景泉，黃雪松.生姜蛋白酶的分離純化[J].食品科學(xué)，2003（2）：73-79.

[4]MISOOK Kim，Hamilton S E.，Guddat L W.，et al.Plant collagenase：Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007，1770（12）：1627-1635.

[5]黃冬香，李小華，李林，等.生姜蛋白酶的研究進(jìn)展及其在食品加工中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2009，30（12）：406-409.

[6]范金波，侯宇，黃訓(xùn)文，等.生姜蛋白酶的分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（5）：65-69.