嚴(yán)重?zé)齻颊咄庵苎行粤＜?xì)胞趨化功能的變化及影響因素

蔣 逸，施文娟，徐琦量，周 劍，王惠康，戴 強(qiáng)，偰時(shí)歡

（溧陽市人民醫(yī)院燒傷整形科，江蘇 溧陽 213300）

感染是燒傷患者常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。感染是導(dǎo)致燒傷患者發(fā)生多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）、全 身 炎 癥 反 應(yīng) 綜 合 征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、膿毒癥休克及死亡的主要危險(xiǎn)因素[1]。有研究表明，感染可使燒傷患者出現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡的現(xiàn)象，致使其發(fā)生多器官衰竭、組織損傷等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其死亡[2]。嚴(yán)重?zé)齻颊叩牟∏閺?fù)雜且病程較長，其感染癥狀若未能得到有效的控制，可誘發(fā)MODS、SIRS、膿毒癥休克、燒傷膿毒癥等病癥[3-4]。中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEU）是機(jī)體免疫機(jī)制的第一道防線，其免疫應(yīng)答作用在嚴(yán)重?zé)齻颊叩钟腥局衅鹬P(guān)鍵的作用[5]。本次研究主要是探討嚴(yán)重?zé)齻颊邆笤缙谄渫庵苎狽EU趨化功能的變化及影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為2019年5月至2021年1月期間溧陽市人民醫(yī)院收治的14例嚴(yán)重?zé)齻颊吆屯谠谠撛航邮芙】刁w檢的14例體檢者。將14例嚴(yán)重?zé)齻颊咦鳛檠芯拷M，將接受健康體檢的14例體檢者作為參照組。在研究組患者中，有男性8例，女性6例；其平均年齡為（36.2±10.5）歲。在參照組體檢者中，有男性10例，女性4例；其平均年齡為（35.9±10.2）歲。兩組研究對象的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 研究方法

對兩組研究對象均進(jìn)行外周血NEU、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降 鈣 素 原（procalctionin，PCT）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（neutrophil count，NEUT）、血小板計(jì)數(shù)（platelet count，PLT）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count，WBC）、腫 瘤 壞 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 介 素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）檢測。然后，對兩組研究對象的檢測結(jié)果進(jìn)行分析研究，總結(jié)嚴(yán)重?zé)齻颊邆笤缙谄銷EU趨化功能變化的情況及影響因素。對研究對象進(jìn)行外周血NEU、CRP、PCT、NEUT、PLT、WBC、TNF-α、IL-6和IL-10檢測的方法是：1）在研究組患者入院后的第1 d、第3 d和第5 d及參照組體檢者接受體檢的當(dāng)天，使用4個2 mL的采血管采集其外周靜脈血作為檢測標(biāo)本。2）對研究對象進(jìn)行外周血NEU檢測。⑴使用Ficoll密度梯度離心法分離研究對象的NEU。分別取研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及參照組體檢者的檢測標(biāo)本，按照1:1的比例向檢測標(biāo)本中加入30 g/L的右旋糖酐，將檢測標(biāo)本在室溫條件下靜置20 min后，提取上清液。對上清液進(jìn)行離心處理（時(shí)間為10 min，重力加速度為400×g，溫度為15℃）后，加入3 mL 的Hank平衡鹽溶液（不含鈣離子和鎂離子），再次對其進(jìn)行懸浮、沉淀處理。避光吸取3 mL的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液后繼續(xù)進(jìn)行離心處理（時(shí)間為0.5 h，重力加速度為400×g，溫度為20℃），除去上清液后使用裂解液對沉淀物中的紅細(xì)胞進(jìn)行裂解，再次對經(jīng)裂解的紅細(xì)胞進(jìn)行離心處理（時(shí)間為0.5 h，重力加速度為400×g，溫度為20℃）。重復(fù)進(jìn)行2次的紅細(xì)胞裂解，除去上清液后即獲得濃度為5×106個/mL 的NEU。⑵使用瓊脂糖趨化試驗(yàn)法檢測外周血NEU的趨化距離。①在RPMI 1640培養(yǎng)基（含有4.6 mL的熱滅活胎牛血清）中加入0.55 g的瓊脂糖，再將其與Hank平衡鹽溶液混合并輕微震蕩后配制成混合液。②將配制好的混合液靜置在溫度為70℃的熱水箱中進(jìn)行20 s的水浴，然后將其放在無包被的培養(yǎng)皿（直徑為35 mm）中，在室溫條件下讓其冷卻凝固。③在空心管（孔徑為3.5 mm）上打3個孔（間距為2.4 mm）。④將從研究組患者檢測標(biāo)本中分離出的NEU的細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/mL，分別將10 μL的NEU加入空心管兩邊的孔內(nèi)，再將同體積的1L趨化物IL-8加入到空心管中間的孔內(nèi)。⑤將空心管置于含有5%CO2的培養(yǎng)箱中（溫度為37℃）進(jìn)行2 h的培養(yǎng)，然后在顯微鏡（倒置，40倍）下觀察NEU的趨化距離。⑥分別取研究組患者入院后第3 d和參照組體檢者接受體檢當(dāng)天的外周血NEU進(jìn)行離心處理（時(shí)間為10 min，400×g，溫度為4℃），然后對經(jīng)離心處理后的細(xì)胞重新使用預(yù)冷項(xiàng)目緩沖存儲器（program buffer storage，PBS）進(jìn)行3次懸浮處理，去除上清液，再次使用結(jié)合緩沖液（100 μL）對細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理。將適量的鼠抗人CXCR、CXCR2流式抗體（分別經(jīng)藻紅/藻藍(lán)蛋白標(biāo)記）加入經(jīng)處理后的細(xì)胞中，孵育0.5 h。對孵育后的細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，再次使用500 μL的結(jié)合緩沖液對其進(jìn)行懸浮處理，最后使用流式細(xì)胞儀檢測外周血NEU中CXCR1、CXCR2等趨化因子受體的表達(dá)情況。3）分別取研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及參照組體檢者的檢測標(biāo)本進(jìn)行CRP、PCT、NEUT、PLT、WBC檢測。4）分別取研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d及參照組體檢者的檢測標(biāo)本，在室溫條件下靜置0.5 h后對其進(jìn)行離心處理（時(shí)間為10 min，重力加速度為400×g），提取血清。使用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象外周血NEU趨化距離的比較

研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血NEU的趨化距離均短于參照組體檢者，P＜0.05。詳見表1。

表1 兩組研究對象外周血NEU趨化距離的比較（μm，±s）

表1 兩組研究對象外周血NEU趨化距離的比較（μm，±s）

注：*與參照組相比，P＜0.05。

組別 外周血NEU的平均趨化距離研究組（n=14）入院后第1 d 1478±103*入院后第3 d 1394±83*入院后第5 d 1016±92*參照組（n=14） 1901±121

2.2 兩組研究對象外周血NEU中趨化因子受體CXCR1和CXCR2陽性表達(dá)率的比較

研究組患者外周血NEU中趨化因子受體CXCR1和CXCR2的陽性表達(dá)率均低于參照組體檢者，P＜0.05。詳見表2。

表2 兩組研究對象外周血NEU中趨化因子受體CXCR1和CXCR2陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

表2 兩組研究對象外周血NEU中趨化因子受體CXCR1和CXCR2陽性表達(dá)率的比較（%，±s）

注：*與參照組相比，P＜0.05。

組別 CXCR1的陽性表達(dá)率 CXCR2的陽性表達(dá)率研究組（n=14） 48.2±1.7* 79.1±1.7*參照組（n=14） 95.5±4.4 97.7±2.2

2.3 兩組研究對象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比較

研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血CRP、PCT、WBC和NEUT的水平均高于參照組體檢者，其外周血PLT的水平與參照組體檢者相比，P＞0.05。詳見表3。

表3 兩組研究對象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比較（±s）

表3 兩組研究對象外周血CRP、PCT、WBC、NEUT和PLT水平的比較（±s）

注：*與參照組相比，P＜0.05。

組別 CRP的平均水平（mg/mL）PCT的平均水平（ng/mL）WBC的平均水平（×109/L）NEUT的平均水平（×109/L）PLT的平均水平（×109/L）研究組（n=14）入院后第1 d 79.2±1.4* 4.6±2.2* 13.5±3.9* 7.8±0.03* 187±92入院后第3 d 96.4±0.5* 5.9±2.4* 13.2±2.7* 9.6±0.01* 194±93入院后第5 d 89.5±0.1* 6.1±1.2* 14.1±3.4* 11.2±0.54* 213±83參照組（n=14）5.1±2.5 0.4±0.1 6.5±2.2 1.8±0.05 218±95

2.4 兩組研究對象外周血各項(xiàng)炎性細(xì)胞因子水平的比較

研究組患者入院后第1 d、第3 d和第5 d其外周血TNF-α、IL-6和IL-10的水平均高于參照組體檢者，P＜0.05。詳見表4。

表4 兩組研究對象外周血各項(xiàng)炎性細(xì)胞因子水平的比較（pg/mL，±s）

表4 兩組研究對象外周血各項(xiàng)炎性細(xì)胞因子水平的比較（pg/mL，±s）

注：*與參照組相比，P＜0.05。

組別 TNF-α的平均水平IL-6的平均水平IL-10的平均水平研究組（n=14）入院后第1 d 7.5±3.1* 12.1±1.1* 181.2±2.2*入院后第3 d 9.6±3.0* 11.7±2.2* 156.4±1.2*入院后第5 d 10.7±1.5* 9.6±3.1* 233.8±2.9*參照組（n=14）1.1±0.2 2.4±0.5 2.4±1.3

3 討論

感染是導(dǎo)致燒傷患者死亡或發(fā)生膿毒癥的重要原因。人體外周血白細(xì)胞中NEU的含量最為豐富，約占白細(xì)胞總含量的50%～70%。NEU具有黏附、脫顆粒、趨化、活化、吞噬等一系列復(fù)雜的生理學(xué)功能，是人體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞[6]。NEU可起到抗感染的作用[7]。NEU的趨化是指NEU向感染部位做定向運(yùn)動的過程。NEU的趨化功能出現(xiàn)障礙，可致使機(jī)體無法有效地抵抗病原菌，進(jìn)而可引起MODS[8]。有研究表明，燒傷患者發(fā)生死亡與其外周血NEU的遷移失敗密切相關(guān)[9]。本次研究的結(jié)果證實(shí)，嚴(yán)重?zé)齻颊邆笤缙谄渫庵苎狽EU的趨化功能會出現(xiàn)一定程度的障礙，此情況的發(fā)生與其外周血NEU中CXCR1、CXCR2等趨化因子受體的陽性表達(dá)及其外周血CRP、PCT、WBC、NEUT、TNF-α、IL-6和IL-10水平的升高有關(guān)。