濕度對(duì)甘薯愈傷的影響

魏 蕾 劉開夢 董中富 徐靜嶷 吳怡嬌 熊春雨 孫 潔 王彩霞

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 100125)

甘薯(Ipomone batatasL)，又稱紅薯、番薯，是世界第七大、我國第四大糧食作物。新鮮甘薯塊大、皮薄、肉嫩，在采收、貯運(yùn)及銷售過程中容易造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致病菌侵染，降低耐貯性[1]。研究表明，每年約有15%的甘薯因貯藏不當(dāng)而霉?fàn)€，其中因機(jī)械損傷造成病原菌入侵引起的霉?fàn)€占總損失的一半以上[2]。

甘薯受到機(jī)械損傷后，若在適宜的環(huán)境條件下，傷口部位薄壁組織細(xì)胞會(huì)積累聚酚和聚酯類物質(zhì)，推動(dòng)木栓化進(jìn)程，形成愈傷組織[3]。愈傷組織能有效阻止水分蒸騰、氧化變質(zhì)及病原菌侵入，并減少重量損失，維持品質(zhì)[4]。

采后愈傷處理是一些果蔬保持品質(zhì)、減少腐爛變質(zhì)以及延長貯藏期所采取的必要措施[5]。甘薯貯藏前，進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠鷤幚順O為重要。愈傷組織的形成在很大程度上受環(huán)境因素的影響，如溫度、濕度。傳統(tǒng)的甘薯愈傷方式主要有兩種:一是采挖后田間自然晾曬愈傷，二是在專門的愈傷庫內(nèi)控制溫度、濕度實(shí)現(xiàn)人工快速愈傷。第一種方式因甘薯產(chǎn)地氣候條件不同，愈傷時(shí)間和愈傷效果差異較大。近年來，條件可控的第二種愈傷方式受到了廣泛關(guān)注，但各地采用的愈傷條件不盡相同，尤其濕度差異較大，如Yin 等[6]認(rèn)為甘薯適宜的愈傷條件為28.5℃、相對(duì)濕度(relative humidity，RH)85%；Nabubuya 等[7]發(fā)現(xiàn)甘薯在29～31℃、RH63%～65%條件下愈傷后貯藏效果較好。濕度是影響愈傷組織形成的重要因素。一般高濕有利于愈傷組織形成，但高濕也為細(xì)菌繁殖提供了有利條件，甘薯易發(fā)軟腐病[8]。目前，關(guān)于濕度對(duì)甘薯愈傷的研究尚鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)擬針對(duì)濕度對(duì)甘薯愈傷的影響展開研究，從愈傷組織木質(zhì)素積累、失重、呼吸強(qiáng)度、酶活、愈傷次生代謝產(chǎn)物等角度闡述濕度對(duì)愈傷組織形成的影響，并探討相關(guān)機(jī)理，旨在為采后甘薯愈傷提供新的方法和依據(jù)，降低甘薯在貯藏過程中的腐爛率，提高甘薯的貯藏效果及食用品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普薯32 號(hào)購于漳州憫農(nóng)閩味生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，選擇外觀整齊、大小均勻(250±50 g)、無損傷無病蟲害的新鮮甘薯，采挖后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，清洗晾干備用。

乙酰溴、β－巰基乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷、鹽酸羥胺、無水甲醇、聚乙烯吡咯烷酮K30，成都科隆化學(xué)品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備與儀器

E200 光學(xué)顯微鏡，尼康儀器有限公司；LHS－250SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；X3R 高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；UV－1800PC 紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷處理 甘薯清洗后用1%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，蒸餾水沖洗后晾干備用。用消毒后的擦皮刀在甘薯表面中部分別擦傷2 道長40 mm、寬10 mm、深2 mm 的傷口，將損傷甘薯分別置于25±5℃、RH50%±5%和RH80%±5%的培養(yǎng)箱中愈傷。每處理甘薯100 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.2 取樣 分別在愈傷第0、第2、第4、第6 和第8天采用手術(shù)刀取損傷部位及皮下2 mm 處的薯肉組織，錫箔紙包裹后快速凍結(jié)并置于－80℃的超低溫冰箱，備用。

1.3.3 木質(zhì)素含量的測定 參照Yin 等[9]的方法并作修改。取冷凍的愈傷組織1 g，加入6 mL 4℃預(yù)冷的95%乙醇，冰浴下研磨成漿，4℃、8 000 r·min－1條件下離心30 min，棄上清，沉淀用3 mL 95%乙醇沖洗3 次后，再用3 mL 乙醇∶正己烷＝1 ∶2(v∶v)的溶液沖洗3次，收集沉淀并干燥至恒重，干燥物溶于1 mL 25%溴化乙酰冰醋酸溶液，于70℃水浴30 min，然后加入1 mL 2 mol·L－1NaOH 溶液中止反應(yīng)，再加入0.1 mL 7.5 mol·L－1羥胺鹽酸和2 mL 冰醋 酸，于4℃、8 000 r·min－1條件下離心30 min，取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm 波長處測定其吸光度值，重復(fù)3 次。木質(zhì)素含量用OD280·g－1表示，以鮮重計(jì)。

1.3.4 木質(zhì)素積累量的測定 參照姜紅[10]的方法，在愈傷第0、第4、第8 天染色觀察甘薯愈傷組織部位木質(zhì)素積累量并拍照。

1.3.5 失重率的測定 采用稱量法[11]測定甘薯失重率。

1.3.6 呼吸強(qiáng)度的測定 采用靜置吸收法[12]測定整甘薯的呼吸強(qiáng)度，單位以mg·kg－1·h－1表示。

1.3.7 苯丙氨酸解氨酶活性的測定 參照王鴻飛等[13]的方法，稍作修改。稱取冷凍愈傷組織3 g，加入15 mL 提前預(yù)冷的0.1 mol·L－1硼酸緩沖液(pH 值8.8，含1 mmol·L－1EDTA 和50 mmol·L－1β－巰基乙醇)，冰浴研磨成漿，4℃、8 000 r·min－1條件下離心30 min，取上清液量其體積后用于酶活性測定。反應(yīng)體系:在100 μL 粗酶液加入3.9 mL 0.1 mol·L－1硼酸－硼砂緩沖液(pH 值8.8)、1 mL 0.6 mol·L－1L－苯丙氨酸溶液，混勻后于40℃保溫1 h，加入0.2 mL 2 mmol·L－1鹽酸終止反應(yīng)，在290 nm 波長處測定其吸光度值A(chǔ)290nm。單位以每小時(shí)290 nm 波處吸光度值增加0.1為1 個(gè)活性單位(U)，記為U·h－1·g－1。

1.3.8 過氧化物酶活性的測定 采用愈創(chuàng)木酚法[12]測定甘薯愈傷組織部位過氧化物酶活性。單位以每分鐘470 nm 波長處吸光度值上升0.1 為1 個(gè)活性單位(U)，記為U·min－1·g－1。

1.3.9 多酚氧化酶活性的測定 采用鄰苯二酚法[12]測定甘薯愈傷組織部位多酚氧化酶活性。單位以每分鐘420 nm 波長處吸光度值上升0.1 為1 個(gè)活性單位(U)，記為U·min－1·g－1。

1.3.10 總酚、類黃酮含量的測定 根據(jù)Yin 等[9]的方法并做修改。取冷凍的愈傷組織1 g，加入5 mL 4℃預(yù)冷的1% 鹽酸－甲醇，冰浴研磨成漿，暗處反應(yīng)20 min后，4℃、8 000 r·min－1條件下離心30 min，取上清液分別在280 nm 和325 nm 波長處測定其吸光度值，總酚和類黃酮含量分別用OD280·g－1和OD325·g－1表示，以鮮重計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS Statistics 18.0 軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕度對(duì)甘薯木質(zhì)素生成的影響

木質(zhì)素是果蔬損傷愈合過程中由肉桂醇、咖啡醇等木質(zhì)素單體聚合而成的復(fù)合物，具有防止水分及養(yǎng)分流失、抵抗病菌侵染的作用。木質(zhì)素的生成量和積累時(shí)間可作為傷口愈合程度的判定依據(jù)[14]。由圖1 可知，愈傷期間，兩組濕度條件下的甘薯木質(zhì)素含量均隨愈傷時(shí)間延長呈先上升后下降的趨勢，RH80%愈傷組甘薯的木質(zhì)素含量始終高于RH50%愈傷組，第4 天時(shí)，RH80%愈傷組甘薯的木質(zhì)素含量比RH50%組高20.69%。由圖2 可知，在愈傷過程中，RH80%愈傷組甘薯傷口處的木質(zhì)素染色始終深于RH50%愈傷組，愈傷4 d 的效果更為明顯，其染色更深、寬度更大，這與木質(zhì)素含量結(jié)果一致，即高濕條件有利于甘薯損傷部位木質(zhì)素的生成，加速木栓化進(jìn)程，促進(jìn)傷口愈合。

2.2 濕度對(duì)甘薯失重率的影響

當(dāng)甘薯遭受機(jī)械損傷后，會(huì)加速其水分流失，導(dǎo)致重量損失嚴(yán)重。愈傷組織能有效阻止水分蒸發(fā)散失，其愈合程度越高，水分蒸發(fā)越慢，失重率越低[4]。由圖3 可知，在愈傷期間，兩組濕度條件下甘薯的失重率均隨愈傷時(shí)間延長逐漸升高，RH80%愈傷組甘薯的失重率顯著低于RH50%愈傷組。高濕愈傷有利于降低甘薯失重率主要?dú)w結(jié)于兩方面:一是高濕條件下水分蒸騰速率低；二是高濕加速了甘薯愈傷組織的形成，延緩了水分從機(jī)械傷口蒸發(fā)的速度。說明甘薯在高濕環(huán)境中愈傷能有效降低蒸騰作用，減少重量損失，延緩品質(zhì)下降。

2.3 濕度對(duì)甘薯呼吸強(qiáng)度的影響

機(jī)械損傷引起的呼吸強(qiáng)度變化與植物體內(nèi)的代謝活動(dòng)密切相關(guān)，呼吸作用為愈傷相關(guān)的代謝活動(dòng)提供物質(zhì)和能量[15]。由圖4 可知，在愈傷期間，RH80%愈傷組甘薯在第2 天呼吸強(qiáng)度達(dá)到最高峰后緩慢下降，RH50%愈傷組甘薯呼吸強(qiáng)度在第4 天達(dá)到頂峰后下降。表明甘薯在高濕條件下呼吸高峰提前，損傷部位的新陳代謝加快，及時(shí)為傷口愈合提供了底物和能量，促進(jìn)了愈傷組織形成。

2.4 濕度對(duì)甘薯酶活性的影響

苯丙烷代謝在愈傷過程中發(fā)揮著重要作用[16]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)是苯丙烷代謝關(guān)鍵限速酶，傷口部位PAL 活性的提高可促進(jìn)酚類物質(zhì)的積累[17]。由圖5-A 可知，在愈傷過程中RH80%愈傷組甘薯PAL 活性顯著高于RH50%愈傷組，愈傷4 d 時(shí)，RH80%愈傷組甘薯PAL 活性達(dá)到最高值，比RH50%愈傷組高22.49%，表明RH80%愈傷處理對(duì)甘薯PAL 活性的提高起到了促進(jìn)作用。植物遭受機(jī)械損傷后可激活細(xì)胞壁中的過氧化物酶(peroxidase，POD)，催化受傷處細(xì)胞壁組分形成一層不透水、不透氣的屏障，加快受傷細(xì)胞壁的修復(fù)和新細(xì)胞壁的合成。有研究表明，POD 活性的升高有利于植物木質(zhì)素和植保素的生成，可促進(jìn)快速愈傷[18]。由圖5-B 可知，甘薯POD 活性變化呈單峰型變化趨勢，愈傷2～8 d 時(shí)，RH80%愈傷組甘薯POD 活性均顯著高于RH50%愈傷組；且在愈傷4 d 時(shí)，RH80%愈傷組甘薯POD 活性急劇升高至最大值，較RH50%愈傷組高46.41%，說明甘薯在高濕條件下愈傷能有效提高POD活性。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)可以催化酚類物質(zhì)氧化形成醌。醌是一類比酚氧化能力更強(qiáng)的物質(zhì)，能直接抑制病原菌的生長，對(duì)愈傷組織的形成也具有幫護(hù)作用[19]。由圖5-C 可知，兩組濕度條件下甘薯PPO 活性變化趨勢與PAL、POD 活性基本一致，愈傷4 d 時(shí)，RH80%愈傷組甘薯PPO 活性較RH50%愈傷組高21.68%。因此，甘薯于RH80%條件下愈傷在一定程度上有利于PPO 活性的增加。甘薯酶活性試驗(yàn)結(jié)果與木質(zhì)素生成的結(jié)果一致，說明甘薯于高濕環(huán)境下愈傷，其PAL、POD、PPO 活性升高，有利于木質(zhì)素大量沉積，加速細(xì)胞壁木栓化進(jìn)程，強(qiáng)化了甘薯細(xì)胞壁，對(duì)甘薯傷口快速愈合十分有利。

2.5 濕度對(duì)甘薯總酚含量的影響

酚類物質(zhì)作為木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，不僅可以抑制病原菌通過傷口侵染果實(shí)，而且可參與愈傷組織的形成[17]。由圖6 可知，兩組濕度條件的甘薯總酚含量在愈傷第4 天時(shí)達(dá)到頂峰，RH80%愈傷組甘薯總酚含量比RH50%愈傷組高16.15%，隨后總酚含量開始下降，這是由于PPO 將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，以降低甘薯被侵染的程度[20]。可見，甘薯在高濕環(huán)境下愈傷能促進(jìn)酚類物質(zhì)的積累，增強(qiáng)抗氧化能力。

2.6 濕度對(duì)甘薯類黃酮含量的影響

類黃酮是一類重要的植保素，能有效抑制病原物的擴(kuò)展，其產(chǎn)生速率和積累量常作為評(píng)價(jià)植物抗病性的重要指標(biāo)[21]。由圖7 可知，兩組甘薯的類黃酮含量變化趨勢整體一致，前期逐漸上升后期緩慢下降，于第4 天達(dá)到最大值，且RH80%愈傷組甘薯類黃酮含量比RH50%愈傷組顯著提高17.05%。說明甘薯在高濕條件下愈傷生成的類黃酮含量高，其抗病性強(qiáng)。

2.7 高濕處理后甘薯木質(zhì)素含量、酶活性及代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性分析

由表1 可知，高濕條件下(RH80%)甘薯PAL 活性與PPO 活性呈極顯著正相關(guān)，表明PPO 活性在催化苯丙烷代謝途徑發(fā)展中做出了積極貢獻(xiàn)。高濕條件下 甘薯木質(zhì)素含量與PAL 活性、POD 活性、PPO 活性、總酚含量、類黃酮含量呈顯著正相關(guān)，說明PAL、POD、PPO 活性的激活以及總酚、類黃酮含量的生成和積累對(duì)甘薯木栓化組織的形成發(fā)揮著重要作用。甘薯在高濕條件下POD 活性與總酚、類黃酮含量之間呈顯著正相關(guān)，可見POD 活性的提高對(duì)植保素總酚、類黃酮含量的增加起到了積極作用。

表1 RH80%甘薯木質(zhì)素含量、酶活性及代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性Table 1 Correlation among lignin content，enzyme activity and metabolites of RH80%sweet potato

3 討論

濕度是影響愈傷組織形成的重要影響因素[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在RH80%條件下對(duì)甘薯進(jìn)行愈傷處理，可有效活化苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、POD、PPO，增進(jìn)次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素、總酚、類黃酮的積累，對(duì)甘薯愈傷組織形成起到促進(jìn)作用。

愈傷是甘薯受到損傷后對(duì)外界環(huán)境做出的應(yīng)激反應(yīng)。環(huán)境中的溫度、濕度對(duì)愈傷組織的形成有較大影響。本研究發(fā)現(xiàn)，甘薯于RH80%條件下愈傷能有效減少甘薯重量損失，原因可能是高濕條件下甘薯體內(nèi)水分蒸發(fā)較少以及該條件下利于木栓層形成從而減少水分從損傷部位散失。該結(jié)果與賈雯茹等[23]在高濕貯藏條件下減輕黃瓜果實(shí)冷害的研究結(jié)果相符。苯丙烷代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑之一，PAL 是苯丙烷代謝的限速酶，可催化苯丙烷代謝的第一步反應(yīng)，使L－苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸[24]。反式肉桂酸經(jīng)過一系列反應(yīng)后生成多酚和類黃酮等愈傷組織的基本成分[17]。酚類物質(zhì)本身具有抗病性，可作為病原物的拮抗劑，同時(shí)又作為合成木質(zhì)素的前體物質(zhì)。木質(zhì)素是甘薯傷口愈合過程中形成的一種甘油酚－脂類聚合物，甘薯傷口部位發(fā)生木質(zhì)化即形成愈傷組織，總酚和木質(zhì)素含量的增加有利于甘薯傷口修復(fù)[12]。類黃酮在果蔬受到傷害時(shí)能有效抵抗病原物的侵染[25]。本研究中，甘薯在高濕環(huán)境中愈傷所產(chǎn)生的木質(zhì)素、總酚及類黃酮含量的整體變化趨勢與PAL 活性變化結(jié)果基本一致，這可能與甘薯傷口部位PAL 活性調(diào)控相關(guān)?？梢?，高濕環(huán)境中愈傷能促進(jìn)甘薯傷口部位苯丙烷代謝酶活性提高和次生代謝產(chǎn)物含量增加。

POD 和PPO 是苯丙烷代謝途徑的2 種末端酶。POD 在果蔬體內(nèi)參與膜脂過氧化，可催化分解過氧化氫使木質(zhì)素單體發(fā)生聚合而參與木質(zhì)素的合成，促進(jìn)愈傷組織的形成[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘薯在高濕環(huán)境中愈傷利于POD 活性的提高，這與薛婧[27]研究山藥貯藏的結(jié)果類似。PPO 不僅是植物體內(nèi)重要的次生代謝酶，能催化木質(zhì)素形成，促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化以抵抗病原菌的侵染，還參與活性氧的代謝，生成氧中間體，在防御機(jī)制中起重要作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濕處理在一定程度上促進(jìn)甘薯愈傷期間PPO 活性升高，這與陳國剛等[29]在庫爾勒香梨上的研究基本一致。范存斐等[30]認(rèn)為苯丙烷代謝途徑的激活可能與該途徑中多種編碼抗性酶防衛(wèi)基因的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。本研究中高濕條件下苯丙烷代謝增強(qiáng)可能也與高濕環(huán)境中此類基因的表達(dá)活躍相關(guān)，具體機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。此外，高濕環(huán)境對(duì)愈傷甘薯活性氧代謝、能量代謝的影響及機(jī)制仍有待深入探索。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，與低濕(RH50%)相比，采后受到機(jī)械損傷的甘薯在高濕(RH80%)條件下愈傷可提高木質(zhì)素累積、降低失重率。高濕條件可促進(jìn)甘薯呼吸高峰提前，提高苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、POD、PPO的活性以及次生代謝產(chǎn)物總酚和類黃酮的含量。因此，采后高濕條件有利于激發(fā)甘薯損傷部位的苯丙烷代謝，加速機(jī)械損傷甘薯愈傷組織的形成。