基于核酸適配體檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1的方法

彭臻菲，李泳寧，黃 慧，陳雅婷，林殿霞

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 福建 福州 350101)

0 引言

【研究意義】食品、農(nóng)產(chǎn)品、飼料發(fā)霉變質(zhì)是一個(gè)全球性的嚴(yán)重問(wèn)題，其產(chǎn)生的霉菌毒素危害極大，對(duì)人和動(dòng)物具有很強(qiáng)的毒性作用。霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，已知的霉菌毒素約有300種，黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一族結(jié)構(gòu)相似、毒性極強(qiáng)的化合物，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最強(qiáng)，具有強(qiáng)致畸、致突變、致癌作用[1-3]，因此黃曲霉毒素引起的污染問(wèn)題越來(lái)越受到人們的關(guān)注，而建立快速、靈敏的檢測(cè)方法是確保食品和農(nóng)產(chǎn)品安全使用的重要保障。【前人研究進(jìn)展】目前，對(duì)AFB1的分析檢測(cè)方法已有大量研究，主要有薄層層析法[4]、高效液相色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]和生物傳感器法[8]等，這些方法均能實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的定量和定性分析，但更方便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法仍是目前研究的熱點(diǎn)?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，快速發(fā)展的基于核酸適配體的檢測(cè)技術(shù)由于其靈敏度高和特異性強(qiáng)，成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。核酸適配體和抗體一樣具有高度特異性和親和力，已廣泛應(yīng)用于抗生素[9]、霉菌毒素[10]、蛋白質(zhì)[11]及整個(gè)細(xì)胞[12]的檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用與AFB1具有高特異性結(jié)合的核酸適配體末端標(biāo)記熒光，其與AFB1特異性結(jié)合后空間構(gòu)象的改變，與偶聯(lián)BHQ1的互補(bǔ)序列無(wú)法配對(duì)，導(dǎo)致熒光值變化而實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料中AFB1的快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度檢測(cè)與分析。

1 材料與方法

1.1 材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、桔霉素(citrinin，CIT)、赭曲霉素A(ochratoxin A，OTA)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)均為Sigma公司生產(chǎn)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為北京索萊寶公司生產(chǎn)，鏈親和素為上海源葉生物公司生產(chǎn)；AFB1核酸適配體5′-6-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC-3′Biotin，結(jié)合探針5′-GACAACACGTGCCCAAC-3′-BHQ1參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)，由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純；超聲波提取儀(KQ-700DE)為昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)，SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 鏈親和素包被濃度的優(yōu)化 鏈親和素用碳酸鈉溶液進(jìn)行稀釋，濃度分別為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL和1 000 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃包被過(guò)夜，用1% BSA進(jìn)行封閉2 h后用PBST清洗3次，扣干。加入1 000 nmol/L核酸適配體進(jìn)行反應(yīng)，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)為518 nm。

1.2.2 核酸適配體濃度的優(yōu)化 為使標(biāo)記生物素核酸適配體與包被于板上的鏈親和素反應(yīng)達(dá)到平衡，將核酸適配體用Tris-HCl 緩沖液(pH 7.5，NaCl 120 mmol/L、MgCl240 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )稀釋成濃度分別為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1 000 nmol/L，在包被鏈親和素的96孔微孔板中分別加入100 μL不同濃度的核酸適配體，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.3 互補(bǔ)序列濃度的優(yōu)化 將互補(bǔ)序列用Tris-HCl 緩沖液稀釋成濃度分別為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1000 nmol/L，在上述優(yōu)化的核酸適配體濃度反應(yīng)后，洗滌，分別加入100 μL不同濃度的互補(bǔ)序列，37℃振蕩孵育30 min。用PBST清洗數(shù)次，扣干，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用甲醇溶解AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，再用HEPES緩沖液 (pH 7.0，NaCl 120 mmol/L 、KCl 5 mmol/L 、MgCl220 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )將AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成濃度分別為0、0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。在包被鏈親和素的96孔微孔板中加入100 μL上述優(yōu)化濃度的核酸適配體，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干；分別加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，37℃反應(yīng)30 min后，用PBST清洗數(shù)次，扣干。再加入上述優(yōu)化的互補(bǔ)序列，37℃反應(yīng)30 min后，用PBST清洗數(shù)次，扣干。最后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 交叉反應(yīng)性分析 選擇AFB1的結(jié)構(gòu)類似物AFB2、AFG1、AFG2及其他霉菌毒素CIT和OTA等作為標(biāo)準(zhǔn)品，溶解稀釋成1 ng/mL和10 ng/mL，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 飼料樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收率測(cè)定 從市場(chǎng)收集飼料樣品數(shù)個(gè)，準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品，加入10 mL甲醇進(jìn)行提取，渦旋劇烈振蕩5 min，超聲提取30 min，濾紙過(guò)濾，收集濾液1。濾餅再用10 mL甲醇溶解后超聲提取，過(guò)濾后收集濾液2。合并2次收集的濾液，濃縮至盡干，加入HEPES緩沖液1 mL進(jìn)行溶解后，采用上述方法檢測(cè)樣品中AFB1含量。選擇未檢出AFB1的飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分別向1.0 g飼料樣品中添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成液體后加入)，使樣品中含有1.0 ng/g、5.0 ng/g和10.0 ng/g AFB1，提取后采用建立的方法測(cè)定樣品的AFB1含量，計(jì)算飼料樣品的AFB1回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈親和素包被的優(yōu)化濃度

從圖1看出，隨著包被鏈親和素濃度的增大，熒光強(qiáng)度也隨之增加，當(dāng)鏈親和素濃度達(dá)100 μg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)檢測(cè)最大值，再增大鏈親和素濃度其熒光值不再增加，表明此時(shí)微孔上包被的鏈親和素已達(dá)飽和，因此鏈親和素濃度選擇100 μg/mL。

圖1 鏈親和素包被濃度的優(yōu)化

2.2 核酸適配體的優(yōu)化濃度

從圖2看出，隨著核酸適配體濃度的增大，熒光強(qiáng)度也隨之增加，當(dāng)核酸適配體濃度達(dá)250 nmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)最大值，表明核酸適配體上標(biāo)記的生物素與包被于板上的鏈親和素已達(dá)平衡，再增大核酸適配體濃度，其熒光強(qiáng)度的變化不大，因此核酸適配體濃度選擇250 nmol/L。

圖2 核酸適配體濃度的優(yōu)化

2.3 互補(bǔ)序列的優(yōu)化濃度

從圖3看出，隨著互補(bǔ)序列濃度的增大，熒光值顯著降低，原因主要是互補(bǔ)序列與核酸適配體的結(jié)合使得其標(biāo)記的BHQ1基團(tuán)能有效地淬滅6-FAM基團(tuán)的熒光，熒光強(qiáng)度隨著互補(bǔ)序列濃度的增大而降低，當(dāng)互補(bǔ)序列濃度達(dá)500 nmol/L時(shí)，熒光值為1 500 a.u，濃度再增大熒光值變化不大，因此互補(bǔ)序列濃度選擇500 nmol/L。

圖3 互補(bǔ)序列濃度的優(yōu)化

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖4看出，AFB1濃度為0.01～10.0 ng/mL時(shí)有較好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y= 4 625.3x+ 11 838(R2= 0.984 9)，最低檢測(cè)限為0.01 ng/mL。

從表1看出，建立的AFB1檢測(cè)方法除與AFB2有一定的交叉反應(yīng)率外，最大交叉反應(yīng)率為2.8%，與AFG1、AFG2、CIT和OTA的交叉反應(yīng)率均低于0.7%，表明試驗(yàn)建立的方法具有較好的特異性。

表1 AFB1檢測(cè)方法與結(jié)構(gòu)相似物的交叉反應(yīng)率

2.6 樣品中AFB1加標(biāo)回收率

從表2看出，在飼料樣品中添加3個(gè)濃度AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為91.3%～105.0%，回收率較高，表明建立的檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度，效果較好。

表2 飼料樣品中AFB1的加標(biāo)回收率

3 討論

近年來(lái)，霉菌毒素對(duì)人和動(dòng)植物造成的嚴(yán)重危害，廣泛引起政府和大眾對(duì)動(dòng)植物食品安全衛(wèi)生的高度關(guān)注。被霉菌毒素污染的飼料，嚴(yán)重影響動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)會(huì)隨著食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而造成一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題。因此，食品質(zhì)量安全也越來(lái)越引起人們的重視，建立快速、靈敏的霉菌毒素檢測(cè)方法是保障食品安全的重要手段。

核酸適配體指經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段[9]。與基于抗體的酶聯(lián)免疫法相比，酶聯(lián)免疫法方法靈敏、快速、操作簡(jiǎn)單，但會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，精確度有待提高[14]；而核酸適配體具有如抗體一樣的特性，對(duì)可結(jié)合的靶分子有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度親和力，建立的基于核酸適配體的檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高。因此，近年來(lái)已報(bào)道了大量能特異性結(jié)合霉菌毒素的核酸適配體，也開(kāi)發(fā)了基于核酸適配體檢測(cè)AFB1、AFB2和OTA等霉菌毒素的方法和生物傳感器[10]。如CASTILLO等[15]開(kāi)發(fā)了一種基于核酸適配體檢測(cè)AFB1的電化學(xué)傳感器，檢測(cè)靈敏度及選擇性好，檢測(cè)限可達(dá)(0.40±0.03)nmol。班珺等[16]建立了一種基于AFB1與互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸適配體的位點(diǎn)使熒光恢復(fù)的轉(zhuǎn)換熒光法檢測(cè)AFB1的方法，檢測(cè)濃度范圍為1～300 ng/mL，檢出限為0.8 ng/mL，對(duì)花生、玉米樣品的回收率在81.1%～108.3%。金碧瑞等[17]建立了一種基于核酸適配體的上轉(zhuǎn)換熒光紙基傳感器測(cè)定茶水中AFB1的方法，檢測(cè)濃度范圍為0.1～100 ng/mL，最低檢出限為0.03 ng/mL，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。在本研究中，在與AFB1具有高特異性結(jié)合的核酸適體末端標(biāo)記熒光，利用其與AFB1特異性結(jié)合后空間構(gòu)象的改變，與偶聯(lián)BHQ1的互補(bǔ)序列無(wú)法配對(duì)，導(dǎo)致熒光值變化而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，構(gòu)建的方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，可對(duì)飼料中的AFB1進(jìn)行快速檢測(cè)。

4 結(jié)論

建立的基于核酸適配體檢測(cè)AFB1方法，快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，在優(yōu)化條件下，檢測(cè)濃度范圍為0.01～10.0 ng/mL，最低檢測(cè)限可達(dá)0.01 ng/mL，與其他霉菌毒素的交叉反應(yīng)率低，在飼料樣品中加標(biāo)回收率高，可用于飼料中AFB1的分析檢測(cè)。