枸杞多糖的水提醇沉法工藝優(yōu)化

胡玲玲， 烏雪燕

(安康學院 化學化工學院， 陜西 安康 725000)

0 引言

【研究意義】枸杞屬茄科植物，主要產(chǎn)于寧夏、甘肅及新疆等地，其成熟的漿果干燥后稱為枸杞子，是一種較名貴且歷史悠久的藥食同源中藥材。中醫(yī)認為，枸杞具滋補肝腎、保健明目的功效[1-2]。藥理研究表明，枸杞含有多糖、生物堿及類胡蘿卜素、黃酮多酚等多種復雜的生物成分[3]。其中，枸杞多糖是枸杞中最主要的生物活性物質之一，具有調節(jié)免疫、清除自由基、調節(jié)血糖血脂等生理功效，因而倍受關注，也是評價枸杞質量的重要依據(jù)之一[4-5]。開展枸杞多糖等活性物質提取方面的研究，對擴大其在食品加工、生物制藥等方面的開發(fā)利用具有現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】提取植物多糖的方法主要有傳統(tǒng)的水提醇沉提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和超臨界流體萃取法等[6-12]。郭錦濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)53%vol白酒浸泡20 d后枸杞浸提酒的黃酮含量和多糖含量分別為0.031 mg/mL和5.83 mg/mL，浸提效果最佳。許英瑞等[11]研究得到超聲提取黑枸杞(LyciumruthenicumMurray)多糖的最佳工藝條件：液料比(mL∶g)41.50∶1，提取時間16 min，超聲功率418 W，此時黑枸杞多糖的提取率達14.13%。吳佳欣等[12]對枸杞多糖提取工藝進行優(yōu)化，提出其最佳提取工藝：液料比(mL∶g)36.6∶1，溫度93.2℃，時間3.9 h，此時多糖提取率為4.28%?！狙芯壳腥朦c】每種方法各有特點，酶法除考慮影響酶活性的各種因素外，還要考慮酶濃度、底物濃度等因素對提取物的影響，對實驗條件要求較高；微波法一般對水的穿透深度為2～3 cm，穿透深度有限；超臨界流體萃取法需要有高溫高壓的技術條件，均不利于工廠化生產(chǎn)。傳統(tǒng)的水提醇沉法提取時間長，溫度高，對多糖的生物活性有不利影響，而超聲波空化效應可以縮短提取時間，避免長時間的高溫提取操作對有效成分的破壞。【擬解決的關鍵問題】采用單因素試驗與正交試驗相結合，以枸杞多糖的得率為評價指標，通過超聲波輔助優(yōu)化傳統(tǒng)水提醇沉法提取工藝，以期為枸杞多糖的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞 中藥材枸杞，產(chǎn)于寧夏中寧縣，購于安康。

1.1.2 儀器 主要儀器包括Uv-6100PC紫外可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，F(xiàn)W177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋(上?？苽ビ琅d儀器有限公司)，KH-100E超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)，F(xiàn)D-1A-80臺式冷凍干燥機(上海予騰生物科技有限公司)，AE224電子分析天平(上海舜宇恒平儀器有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.1.3 試劑 無水乙醇(AR)(天津市天力化學試劑有限公司)，苯酚(AR)(天津市東麗區(qū)新中村)，無水葡萄糖(AR)(西王藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 取中藥材枸杞50 g于真空干燥箱中60℃干燥12 h，碾碎過篩(24目)，用100 mL有機溶劑(V氯仿∶V甲醇=2∶1)60℃下回流2 h，抽濾，濾渣用相同的方法再重復處理1次，充分除去枸杞中的色素、脂類及低聚糖[13]。濾餅冷凍干燥制成枸杞樣品并稱重(ms)，備用。

1.2.2 繪制標準曲線 無水葡萄糖粉末干燥至恒重，準確稱量25 mg，去離子水溶解后，轉移至250 mL的容量瓶并定容，配制成濃度為100 mg/L葡萄糖標準溶液。分別移取0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL的葡萄糖標準溶液于6個10 mL具塞比色管中，補去離子水至2.00 mL。再分別加入 6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6 mL，充分搖勻后，90℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，然后采用紫外分光光度計在波長(λ)300～800 nm掃描，λ=490 nm處有最大吸光度。因此，可在此處測定枸杞多糖的吸光度[14-15]。以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖標準溶液濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 不同因素對枸杞多糖得率的影響 用精度0.01 g的電子秤準確稱取枸杞樣品2.00 g置于100 mL圓底燒瓶，按照超聲提取→濃縮→冷凍干燥→測定吸光度并計算得率的流程進行單因素提取試驗，分別考察液料比(mL∶g)、超聲提取時長(min)、超聲溫度(℃)及提取次數(shù)等因素對提取得率的影響。

1) 提取時間。分別設定為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min；試驗條件：液料比為20∶1，提取溫度設定為50℃。

2) 提取溫度。分別設定為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃；試驗條件：液料比為20∶1，超聲提取時長設定為25 min。

3) 液料比(mL∶g)。分別設定為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1；試驗條件：超聲提取溫度和提取時長固定為50℃和25 min。各處理2次重復提取，合并濾液并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，加入40 mL 95%乙醇，4℃下靜置沉淀24 h，抽濾，濾渣分別用少量乙醇、丙酮各洗滌1次，得枸杞多糖粗產(chǎn)品。

1.2.4 正交試驗設計優(yōu)化提取工藝 根據(jù)上述單因素試驗結果，采用L9(34)正交試驗設計(表1)，對枸杞多糖水提醇沉法提取工藝中主要影響因素液料比，超聲提取時長和提取溫度進行優(yōu)化，篩選最佳提取工藝。

表1 枸杞多糖提取試驗因素及水平

1.2.5 測定枸杞多糖含量 枸杞粗多糖凍干品，用去離子水溶解配置成250 mL多糖溶液，吸量管移取1.00 mL多糖溶液于10 mL容量瓶中，去離子水定容。再從中取出1.00 mL溶液于比色管中補去離子水至2.00 mL。然后加入6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6.00 mL，充分搖勻，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，測量其吸光度并計算枸杞多糖的提取率。

式中，C由回歸方程所得枸杞粗多糖的濃度(mg/L)，n為稀釋倍數(shù)，D為換算系數(shù)(ms/50)；m為枸杞供試品的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 枸杞多糖的標準曲線

以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖標準溶液濃度(x)為橫坐標繪制得到標準曲線(圖1)。經(jīng)擬合得回歸方程：

圖1 枸杞多糖的標準曲線

y=4.0657x+0.096 9(R2=0.999 3)

說明，葡萄糖標準溶液的濃度在10～60 mg/L，吸光度與葡萄糖濃度存在良好的線性關系。

2.2 不同提取因素處理枸杞多糖的提取率

從圖2看出，不同提取時間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率存在差異。

圖2 不同提取時間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率

2.2.1 提取時間 不同處理枸杞多糖的提取率為8.68%～10.51%，其中，提取時長為20 min時多糖提取率最高，25 min時其次，10 min時最低，依次為20 min>25 min>30 min>15 min>10 min。枸杞多糖提取率隨提取時間的增加呈先升后降趨勢，當提取時長為20 min時達最大，之后下降，可能是隨著提取時間的增長，多糖在溶劑中不斷溶出；隨時間延長，其他雜質在溶劑中溶出也快速增多，使得多糖提取率下降。表明，20 min是較為合適的提取時長。因此，選取提取時間15 min、20 min和25 min進行后續(xù)試驗。

2.2.2 提取溫度 不同處理枸杞多糖的提取率為8.67%～10.66%，其中，提取溫度為60℃時多糖提取率最高，50℃時其次，30℃時最低，依次為60℃>50℃>70℃>40℃>30℃。隨溶劑溫度升高，多糖提取率呈先升后降趨勢，在提取溫度為60℃時達最大，之后下降，可能是枸杞多糖在低溫時溶出較少，隨溫度升高，多糖溶出逐漸增大；溫度較高時多糖易降解，從而使多糖提取率下降。表明，最佳提取溫度以60℃較為適宜。因而，選取提取溫度50℃、60℃和70℃進行后續(xù)試驗。

2.2.3 液料比 不同處理枸杞多糖的提取率為8.61%～10.71%，其中，液料比(mL∶g)為20∶1時多糖提取率最高，25∶1時其次，10∶1時最低，依次為20∶1>25∶1>30∶1>15∶1>10∶1。隨液料比增大，多糖提取率呈先升后降趨勢，當液料比大于20∶1之后，提取率又略有下降。原因可能是液料比太小時，溶劑不能完全浸潤藥材，多糖提取不完全。為提高效率，節(jié)省能耗，選擇20∶1的液料比較為適宜。因而，選取液料比15∶1、20∶1和25∶1進行后續(xù)試驗。

2.3 枸杞多糖提取條件優(yōu)化

從表2看出，9個處理枸杞多糖提取率為8.79%～10.66%，其中，處理5(A2B2C3)，即液料比20∶1，提取溫度60℃，提取時長25 min時枸杞多糖提取率達最高，為10.66%；處理4(A2B1C2)和處理9(A3B3C2)，即液料比20∶1，提取溫度50℃，提取時長20 min時和液料比25∶1，提取溫度70℃，提取時長20 min時枸杞多糖提取率其次，分別為10.34%和10.32%。從表3和表4可知，各因素對枸杞多糖提取率的影響為A因素(液料比)>C因素(提取時間)>B因素(提取溫度)；液料比和超聲提取時間對提取率影響顯著，而提取溫度對提取率無顯著影響。由K值可知：枸杞多糖提取最佳操作方案為A2B2C2，即超聲輔助提取枸杞多糖的最優(yōu)方案為加入所稱量的枸杞供試品質量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min。

表2 枸杞多糖提取正交試驗設計及結果

表3 枸杞多糖提取條件正交試驗結果的極差分析結果

2.4 方案驗證

由于正交試驗設計中缺少A2B2C2的試驗方案，需進行重復性驗證試驗對優(yōu)選出的A2B2C2處理進行可信性檢驗。從表4看出，在此最佳方案下提取枸杞多糖的平均提取率為10.61%，與正交設計中方案5的提取率接近，且RSD僅為1.13%，說明，優(yōu)選出的提取方案(A2B2C2)，即加入稱量的枸杞供試品質量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min合理、可行。

表4 枸杞多糖正交試驗方差分析結果

表5 枸杞多糖提取的重復性試驗結果

3 討論

水提醇沉法在中藥材的提取分離中應用較廣，該研究利用枸杞多糖溶于水的性質進行水提，隨提取溫度的升高，提取時間的增長，枸杞多糖在提取液中溶解度提高的同時，多糖的水解率也會提高，使得枸杞多糖的提取率較低。超聲波能夠在植物組織內部形成空化作用，以及本身的振動作用大大促進了多糖的溶解、擴散，不僅縮短了提取時間，也不需要太高的提取溫度。在提高提取率的同時，對多糖結構的破壞較小。將超聲法與傳統(tǒng)的水提法結合，保留了水提的優(yōu)點，縮短了提取時間長，提高了提取率，且提取過程簡單、易操作。該研究經(jīng)優(yōu)化得到提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時間20 min。較之吳佳欣等[12]的研究，該研究既減少了液料比，降低了提取溫度，縮短了提出時間，還提高了多糖提取率。

4 結論

試驗采用傳統(tǒng)的水提醇沉結合超聲波法提取枸杞多糖，選擇液料比、提取時間和提取溫度3個因素，結合L9(34)正交表優(yōu)選枸杞多糖的提取方案。提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時間20 min。在此方案下，枸杞粗多糖的提取率較高，均值達10.61%。提取線路簡單、易操作，多糖提取率較高，為枸杞粗多糖進一步純化研究奠定了基礎。