酒糟堆肥固氮微生物的篩選及性能研究

曾祥煉，席曉黎，吳耀領(lǐng)，王和玉，王 莉

(貴州茅臺酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州 仁懷 564500)

0 引言

【研究意義】我國白酒年生產(chǎn)量大約為119.81億L，而2019年酒糟的排放量已達(dá)5 000萬t以上[1]。酒糟酸度大，水分含量50%以上，有機(jī)質(zhì)含量高[2-4]，極易腐敗，不便存儲，若不及時(shí)處理，易對環(huán)境造成較大的污染，嚴(yán)重威脅釀酒企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。酒糟作為白酒生產(chǎn)的副產(chǎn)物，富含氨基酸、脂質(zhì)、淀粉、纖維素和木質(zhì)素等營養(yǎng)成分[5-6]，含有豐富的氮(3.5%)、磷(0.41%)等植物必需元素，重金屬含量、蛔蟲數(shù)、大腸桿菌、抗生素含量極少，是極好的有機(jī)肥源[7]。但目前有關(guān)接種固氮菌于白酒丟糟中生產(chǎn)高氮含量生物有機(jī)肥的研究相對較少，從白酒丟糟中篩選高效固氮能力菌株，對微生物肥料的研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物肥料是一種無毒環(huán)保、環(huán)境友好型肥料，是農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要研究方向之一[8]。微生物肥料通過特定微生物的生命活動，使作物獲得養(yǎng)分供應(yīng)，具有提高作物產(chǎn)量、影響種植土壤微生物結(jié)構(gòu)、改善生態(tài)環(huán)境等多種功能[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在高粱種植過程中施加氮肥和磷肥有助于高粱增產(chǎn)及籽粒支鏈淀粉的積累，而氮、磷、鉀肥不足均會造成高粱產(chǎn)量的下降，尤其以缺施氮肥最為顯著[10-12]，所以有機(jī)肥中氮素含量是其是否適于高粱地施用的重要考察指標(biāo)之一。【研究切入點(diǎn)】目前已知的固氮細(xì)菌主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和聯(lián)合固氮菌3種類型。其中，共生固氮菌與聯(lián)合固氮菌因其對共生植物和生長環(huán)境要求嚴(yán)格，難以被廣泛應(yīng)用，而自生固氮菌則是制造固氮微生物肥料主要菌種，但由于菌種類型和固氮能力強(qiáng)弱等原因，目前市場上銷售的微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量差異較大[13-14]。因此，篩選高效固氮能力菌株，對研發(fā)微生物肥料提供菌種資源顯得尤為迫切?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以白酒丟糟為原料，利用高溫好氧堆肥富集優(yōu)化微生物方式，從堆肥過程的中溫、高溫階段原位篩選具有固氮作用的菌株，并對其氨化性能和固氮能力進(jìn)行研究，為制備高效固氮作用的復(fù)合微生物菌劑提供菌種資源和理論依據(jù)，以利于白酒丟糟堆肥的順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 改良的阿須貝氏(Ashby)無氮瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。改良的阿須貝氏(Ashby)無氮液體培養(yǎng)基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、蒸餾水1 000 mL。氨化微生物分離培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨分離培養(yǎng)基)：牛肉膏3～5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20～30 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121℃蒸汽滅菌30 min。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.4，121℃蒸汽滅菌30 min。YPD培養(yǎng)基：酵母膏5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g，pH自然，118℃蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 物化材料 鮮酒糟：含水量56.8%、全P 2.34 mg/g、全N 24 mg/g、有機(jī)質(zhì)80.9%、 pH 3.6。風(fēng)干酒糟：調(diào)節(jié)水分至50%～60%。新鮮稻草：粗纖維35.5%～45%、木質(zhì)素21%～26%。以上材料均由貴州茅臺酒股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 氨化微生物的篩選

1) 氨化微生物的初次富集。將風(fēng)干酒糟與新丟酒糟混合配制材料，風(fēng)干酒糟占新丟糟重量的10%左右，利用風(fēng)干酒糟調(diào)節(jié)堆糟水分含量為50%～60%。具體操作：堆體底部直徑2 m左右，堆體呈圓錐形，底鋪1層風(fēng)干酒糟(厚約5 cm)，上鋪1層鮮酒糟(15～20 cm)，如此反復(fù)，至堆體高1.2 m左右完成堆砌。每3 d人工翻堆1次。堆肥48 h(堆體溫度55℃)完成微生物初次富集。

2) 氨化微生物的第2次富集。以初次富集的堆體酒糟作接種材料，新丟酒糟與初次富集的堆體酒糟按2︰1比例混合，并按混合后總重量的1%添加碎稻草，繼續(xù)富集并優(yōu)化微生物，接種后4 d左右完成第2次富集。

3) 中溫微生物樣品采集。待第2次富集堆體平均溫度上升至60℃以上時(shí)，去掉堆體表層的結(jié)殼，在距離表面20 cm處(溫度約45℃)按東南西北4個(gè)方位分別取堆肥樣品，混合后進(jìn)行中溫型微生物的分離和純化。

4) 高溫微生物樣品采集。待第2次富集堆體平均溫度上升至60℃以上，并持續(xù)6 d以上后，去掉堆體表層的結(jié)殼，在距離表面30 cm處(溫度>61℃)按東南西北4個(gè)方位分別取堆肥樣品，混合后進(jìn)行高溫型微生物的分離和純化。

5) 氨化微生物的初步檢測。將分離純化后的微生物制備成菌懸液，用納氏試劑顯色法進(jìn)行初步檢測，若出現(xiàn)紅棕色或黃色沉淀證明培養(yǎng)液中有氨化微生物。

1.2.2 微生物氨化能力測定 將上述篩選出的具有顯色反應(yīng)的微生物菌株活化后，按4%體積比的菌液量接種到200 mL LB液體培養(yǎng)基或YPD液體培養(yǎng)基中，每株菌3個(gè)重復(fù)。然后置于恒溫?fù)u床上120 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h用納氏試劑參照《水質(zhì)銨的測定-納氏試劑比色法》(GB 7479-87)測定液體中氨態(tài)氮含量。并用SPSS對菌株氨態(tài)氮的生成率進(jìn)行分析。

1.2.3 固氮作用考察 將初步篩選得到的菌株分別按5%的接種量(OD600約為1.0)接種于裝有100 mL改良的阿須貝氏無氮液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于28℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。以上每個(gè)步驟均設(shè)3個(gè)重復(fù)和1個(gè)空白對照，凱式定氮法測定固氮效能[15]。

1.2.4 菌株鑒定 將具有氨化作用和固氮性能的菌株保藏，并送中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行16S rRNA序列和ITS序列菌株鑒定及生理生化試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選氨化微生物

2.1.1 微生物初步富集 堆肥24 h后溫度快速升高，48 h后達(dá)55℃以上并進(jìn)入堆肥高溫期。堆肥初期微生物含量為：霉菌1×102CFU/g，細(xì)菌1×105CFU/g。至堆肥48 h時(shí)，完成微生物的初步富集，霉菌含量達(dá)1.2×106CFU/g，細(xì)菌含量達(dá)4.5×107CFU/g。初步堆肥后，微生物含量大幅增加，滿足作為第2次富集接種材料的要求。

2.1.2 中、高溫型堆肥酒糟微生物菌株 通過第2次富集試驗(yàn)，完成對中、高溫型堆肥酒糟微生物的分離純化，初步獲得14株不同菌落形態(tài)的菌株。其中，中溫細(xì)菌有MX1、MX8、MX13、MX3和MJ1共5株，中溫霉菌有MM2、MM1和MM6共3株；高溫細(xì)菌有TX1、TX2和TX3共3株，高溫霉菌有TM2、TM1和TM3共3株。14株不同菌落形態(tài)的菌株在阿須貝培養(yǎng)基中生長良好。

2.1.3 具有氨化性能的菌株 根據(jù)菌株在阿須貝固態(tài)培養(yǎng)基上生長的菌落種類，通過微生物計(jì)數(shù)，選擇具有數(shù)量優(yōu)勢的9株進(jìn)行納氏顯色試驗(yàn)，分別為4株中溫細(xì)菌MX1、MJ1、MX6和MX8，2株中溫霉菌MM2和MM6，1株中溫酵母MJ4，1株高溫霉菌TM1，1株高溫細(xì)菌TX1。根據(jù)納氏顯色試驗(yàn)顯色圈直徑大小篩選出具有氨化性能的菌株5株，分別為MM6、MX8、MX1、TX1和MJ。從圖1看出，MM6、MX8、MX1、TX1和MJ菌株菌納氏試劑顯色后的顯色圈較大，可初步定性為具有氨化作用的菌株。

圖1 菌株的納氏試劑顯色圈直徑

2.2 菌株的氨化能力

從圖2可知，培養(yǎng)0～48 h，MM6、MX1和MX8株菌的氨態(tài)氮增長速率明顯高于TX1和MJ。培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株MX8、MM6、MX1的氨態(tài)氮生成率分別為2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，且與TX1、MJ菌株在48 h時(shí)的生成率存在顯著性差異(P<0.05)，培養(yǎng)48～72 h 期間，MM6、MX1和MX8氨態(tài)氮生成率逐漸下降，TX1和MJ菌株氨態(tài)氮生成率緩慢增加；培養(yǎng)120 h，5株菌氨態(tài)氮的生成速率均接近0。表明，培養(yǎng)過程中菌株MM6、MX1和MX8具有較強(qiáng)的氨化作用。

圖2 菌株液態(tài)培養(yǎng)氨態(tài)氮的生成率

2.3 菌株的固氮性能

從圖3看出，對分離得到的5株菌在無氮液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，MX8菌株總氮含量為22.0 mg/L、MX1為15.8 mg/L，MX8、MX1菌株的固氮能力高于TX1、MM6和MJ菌株， MX8和MX1具備作為生產(chǎn)固氮微生物菌劑的潛力。

圖3 株菌在無氮液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的總氮含量

2.4 菌株鑒定

對5株菌進(jìn)行16SrRNA和gyrB基因序列鑒定，結(jié)果表明， MX8和TX1菌株同屬于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，MX1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，MJ為皺落假絲酵母(Candidarugosa)，MM6為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

根據(jù)理化試驗(yàn)，MX8、MX1和TX1 3株細(xì)菌均為革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)淀粉酶水解淀粉，產(chǎn)蛋白酶水解酪素，能夠還原硝酸鹽，可利用纖維二糖幫助纖維素降解；TX1和MX1菌株還能產(chǎn)果膠酶水解果膠；MX8和TX1不耐酸，pH 5.0下不能生長，屬于兼性厭氧菌；MX1菌株pH 5.0下能生長，屬好氧菌。MJ為皺落假絲酵母，可利用麥芽糖和可溶性淀粉，能同化纖維二糖，該菌不僅能在25℃下迅速生長，在37℃也能生長，用于固體酒糟堆肥能促進(jìn)堆肥有機(jī)物降解，加快堆肥升溫；而MM6在生理生化特性方面不具備作為堆肥菌劑的潛能。

3 討論

氨化微生物能把培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源經(jīng)氧化、還原、轉(zhuǎn)化等步驟逐漸轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮。研究采用納氏試劑顯色法和阿須貝氏(Ashby)無氮培養(yǎng)法從白酒丟糟堆肥中篩選出5株具有氨化能力和固氮作用的菌株，分別為細(xì)菌MX8、TX1和MX1，酵母菌MJ，霉菌MM6。5株菌氨化試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株MX8、MM6、MX1的氨態(tài)氮生成率分別為2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，具有較強(qiáng)的氨化作用。5株菌在無氮液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，菌株MX8、MX1總氮含量分別達(dá)22.0 mg/L、15.8 mg/L，固氮能力強(qiáng)。通過分子生物學(xué)鑒定及生理生化試驗(yàn)表明，菌株MX8和TX1菌株同屬于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，MX1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，MJ為皺落假絲酵母(Candidarugosa)，MM6為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。生理生化試驗(yàn)顯示，MX8、MX1和TX1株菌有一定的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、果膠等有機(jī)質(zhì)的水解能力，MJ能同化纖維二糖，在固體酒糟堆肥過程中能促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的降解，縮短腐熟進(jìn)程，加快堆肥升溫。結(jié)合固氮能力的考察結(jié)果，確定MX8和MX1具備作為生產(chǎn)固氮微生物菌劑的潛能，但因試驗(yàn)條件限制，還未對MX8和MX1進(jìn)行大規(guī)模的固氮生產(chǎn)試驗(yàn)，因此距投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有一定距離。

4 結(jié)論

從白酒丟糟堆肥中篩選得到2株芽孢桿菌MX8和MX1，具有較高的固氮性能，具備作為生產(chǎn)固氮微生物丟糟肥料菌種的潛力。若通過一定規(guī)模生產(chǎn)試驗(yàn)驗(yàn)證其固氮性能，則可作為制備高效固氮作用的復(fù)合微生物菌劑的菌種資源應(yīng)用于白酒丟糟堆肥，以加強(qiáng)白酒丟糟的有效利用，且緩解白酒丟糟造成的環(huán)境污染。