綠蘿離體快繁體系的建立及其甲基磺酸乙酯誘變條件

陸玉建 張永磊

摘要：為了探究綠蘿離體再生的最適條件和甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulphonate，簡稱EMS）誘變綠蘿的合適劑量，首先以綠蘿葉柄為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)。結(jié)果表明，用葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L噻苯?。═DZ）+0.3 mg/L萘乙酸（NAA），不定芽分化最適培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L NAA，生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg/L NAA。然后設(shè)置不同劑量的EMS誘變綠蘿葉柄愈傷組織，并對其存活率、致死率進(jìn)行統(tǒng)計，初步獲得EMS誘變綠蘿愈傷組織的半致死條件：0.6%EMS誘變處理4 h或0.8%EMS誘變處理2 h。研究結(jié)果對于今后利用EMS誘變綠蘿愈傷組織、篩選性狀優(yōu)良的突變體具有重要意義。

關(guān)鍵詞：綠蘿;葉柄;愈傷組織;甲基磺酸乙酯（EMS）;誘變

中圖分類號： S687.904+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0055-06

綠蘿（Eipremnum aureum）為天南星科綠蘿屬多年藤本植物，其形態(tài)優(yōu)美，具有較高的觀賞價值[1]。綠蘿吸收室內(nèi)甲醛的能力較強，深受人們喜愛[2]。此外，綠蘿對鉛、鎘、鉻等重金屬具有一定的富集能力，并能夠通過特定機制將根部積累的重金屬運輸?shù)讲煌课?，因此在凈化低濃度重金屬污染的水體方面效果良好[3-5]。目前綠蘿多采用壓條和扦插的方式進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)低、速度慢、遺傳穩(wěn)定性差，無法在短期內(nèi)得到大量優(yōu)質(zhì)的植株[6]。組織培養(yǎng)是實現(xiàn)綠蘿快速繁殖的有效途徑，近年來的研究主要以綠蘿莖段為外植體，通過愈傷組織分化或直接誘導(dǎo)生芽的方式獲得綠蘿再生植株[7-8]。由于外植體選材的局限性和植物生長調(diào)節(jié)劑對綠蘿離體再生影響的復(fù)雜性，現(xiàn)階段還存在離體再生頻率低的缺點。此外，綠蘿還存在種質(zhì)資源單一的不足?；瘜W(xué)誘變育種是豐富植物種質(zhì)資源的有效途徑，化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulphonate，簡稱EMS）因其誘變頻率高、成本低廉、操作簡便，已成為獲得突變體、創(chuàng)制新種質(zhì)的有效手段[9-11]。鑒于此，為豐富綠蘿種質(zhì)資源、培育出觀賞價值更高和污染清除效果更好的綠蘿新品系，本研究在建立綠蘿高頻離體再生體系的基礎(chǔ)上，通過EMS對綠蘿愈傷組織進(jìn)行誘變，探究EMS誘變綠蘿愈傷組織的最佳劑量，研究結(jié)果對于下一步通過化學(xué)誘變、篩選性狀優(yōu)良的綠蘿突變體具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠蘿于2019年春購自山東省濱州市花卉市場，在濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 根據(jù)前期試驗結(jié)果，重新優(yōu)化培養(yǎng)基組合并配制培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和1%瓊脂。綠蘿葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基C1～C5的配方如下：（1）C1，MS+0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L萘乙酸（NAA）+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）;（2）C2，MS+0.2 mg/L噻苯?。═DZ）+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA;（3）C3，MS+0.2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L激動素（KT）;（4）C4，MS+0.5 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D;（5）C5，MS+0.5 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA。綠蘿帶節(jié)莖段培養(yǎng)和不定芽分化培養(yǎng)基B1～B5的配方如下：（1）B1，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA;（2）B2，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;（3）B3，MS+2.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA;（4）B4，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA;（5）B5，MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。綠蘿不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基R1～R5的配方如下：（1）R1，1/2MS+0.03 mg/L NAA;（2）R2，1/2MS+0.05 mg/L NAA;（3）R3，1/2MS+0.1 mg/L NAA;（4）R4，1/2MS+0.2 mg/L NAA;（5）R5，1/2MS+0.5 mg/L NAA。

1.2.2 材料消毒及無菌苗的獲得 剪取綠蘿帶芽莖段，分別用自來水沖洗30 min、蒸餾水沖洗2次、70%乙醇消毒30 s、0.1%氯化汞處理15 min、無菌水沖洗5～6次后接種于B1～B5培養(yǎng)基上，2周后統(tǒng)計莖段芽的增殖系數(shù)。將莖段產(chǎn)生的芽切下，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，獲得綠蘿無菌苗，相關(guān)計算公式：

芽的增殖系數(shù)=產(chǎn)生的芽數(shù)/接種的莖段數(shù)。

1.2.3 葉柄愈傷組織的誘導(dǎo) 選取綠蘿無菌苗的葉柄接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后按下式統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率：

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%。

1.2.4 不定芽的分化 先將綠蘿葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，30 d后進(jìn)行不定芽分化率的統(tǒng)計，計算公式：

不定芽分化率=（產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%。

1.2.5 不定芽的生根 選取綠蘿不定芽接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)，30 d后按下式統(tǒng)計不定芽的生根率、根增殖系數(shù)：

生根率=（產(chǎn)生不定根的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%;

根增殖系數(shù)=產(chǎn)生的根數(shù)/接種數(shù)。

1.2.6 綠蘿愈傷組織的EMS誘變 用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為5.8）分別配制0、0.4%、0.6%、0.8%EMS溶液，過濾除菌后備用。選取生長良好的綠蘿愈傷組織，放入上述不同濃度的EMS溶液中，分別于100 r/min振蕩培養(yǎng)2、4、6 h。取出綠蘿愈傷組織，用無菌水反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.7 EMS誘變半致死劑量的確定 得到用EMS誘變處理的綠蘿愈傷組織后，繼代培養(yǎng)30 d并觀察統(tǒng)計，根據(jù)愈傷組織的褐化程度和生長狀態(tài)，統(tǒng)計存活率、致死率。將致死率接近50%時的EMS濃度和誘變時間作為綠蘿愈傷組織EMS誘變的合適劑量，用于突變體的誘導(dǎo)，相關(guān)計算公式：

存活率=（外植體的存活數(shù)/接種數(shù)）×100%;

致死率=（外植體的致死數(shù)/接種數(shù)）×100%。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2007和SPSS 17軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過Duncans多重比較進(jìn)行樣本間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶節(jié)莖段芽的誘導(dǎo)

將綠蘿帶節(jié)莖段接種于B1～B5培養(yǎng)基上，接種后1周左右，莖段開始抽芽，接種后2周左右莖段長出明顯的芽，然后進(jìn)行芽的增殖系數(shù)統(tǒng)計。由圖 1-A、圖2-A、圖2-B可以看出，在這5種培養(yǎng)基中，莖段均可產(chǎn)生芽，且芽生長迅速，但數(shù)量較少。其中B3培養(yǎng)基中芽的增殖系數(shù)最高，達(dá)到1.54，B4培養(yǎng)基中芽的增殖系數(shù)最低，僅有1.05，其他3種培養(yǎng)基中芽的增殖系數(shù)介于上述2個數(shù)據(jù)之間。根據(jù)芽的增殖系數(shù)和芽的生長情況，初步確定B3培養(yǎng)基作為帶節(jié)莖段芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。將芽切下后轉(zhuǎn)入B3培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d，芽不斷生長發(fā)育，獲得無菌苗（圖2-C、圖2-D）。

2.2 葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)

選取葉柄為材料進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。由圖1-B可以看出，葉柄在這5種培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生愈傷組織，但誘導(dǎo)率存在明顯差異，其中誘導(dǎo)效果最好的為C5培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率約為98%，且產(chǎn)生愈傷組織的量較多，生長比較旺盛（圖2-E、圖2-F）;其次是C4培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果較好，愈傷組織誘導(dǎo)率接近C5培養(yǎng)基;誘導(dǎo)效果最差的為C1培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率不到10%，葉柄不僅極易褐化，而且愈傷組織產(chǎn)生的量很少。C2、C3培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果一般，愈傷組織誘導(dǎo)率約為30%。根據(jù)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率及其生長情況，初步確定C5培養(yǎng)基作為葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。將愈傷組織轉(zhuǎn)接入C5培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2周后愈傷組織的量明顯增加（圖2-G）。連續(xù)繼代培養(yǎng)2次后，愈傷組織繼續(xù)增殖，并有少量芽點產(chǎn)生（圖2-H）。

2.3 愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)

將葉柄誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B1～B5中。由圖1-C可以看出，在這5種培養(yǎng)基中，葉柄愈傷組織均可分化產(chǎn)生不定芽。在B5培養(yǎng)基中，愈傷組織分化率接近100%，不定芽數(shù)量較多，生長較好。其次為B2培養(yǎng)基，不定芽分化率超過95%。分化效果較差的為B1培養(yǎng)基，芽的分化率只有30%左右，且芽的數(shù)量相對較少。B3、B4培養(yǎng)基的效果一般，不定芽分化率為50%～60%。根據(jù)不定芽分化率及其生長情況，初步確定B5培養(yǎng)基作為綠蘿不定芽分化最適培養(yǎng)基。在B5培養(yǎng)基中，愈傷組織培養(yǎng)1周即可分化出少量不定芽（圖2-I），3周后不定芽明顯繼續(xù)增多、增大（圖2-J）。隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織繼續(xù)分化培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后葉柄兩端產(chǎn)生較多不定芽（圖2-K）。將帶芽葉柄轉(zhuǎn)入B5培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不定芽生長比較旺盛（圖2-L）。切取葉柄兩端的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不定芽數(shù)量繼續(xù)增多（圖2-M、圖2-N）。

2.4 不定芽生根誘導(dǎo)

不定芽生根培養(yǎng)30 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，由圖 1-D 可以看出，在這5種培養(yǎng)基中，不定芽的基部均有根生成，且根的長勢較好，生根率十分接近，其中R2培養(yǎng)基的生根率達(dá)到98%，但根的增殖系數(shù)存在一定差別。在R2培養(yǎng)基中，不定芽的生根系數(shù)最高，約為5.3，且根數(shù)量較多、生長旺盛。在R5培養(yǎng)基中，不定芽的生根系數(shù)最低，約為2.7，且根數(shù)量少、生長較差。在其他3種培養(yǎng)基中，不定芽的生根系數(shù)介于上述2個數(shù)據(jù)之間。根據(jù)根的增殖系數(shù)和根的生長情況，初步確定R2培養(yǎng)基是不定芽誘導(dǎo)生根的最適培養(yǎng)基。選取健壯的不定芽接種于R2培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d即可獲得試管苗（圖2-O、圖2-P）。

2.5 EMS處理對綠蘿愈傷組織生長的影響

選取生長良好的愈傷組織進(jìn)行EMS誘變，培養(yǎng)30 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計，試驗結(jié)果見圖3、圖4-A。

當(dāng)磷酸緩沖液中不含EMS時，無論處理2、4 h還是 6 h，綠蘿愈傷組織均生長正常，葉柄呈現(xiàn)青綠色，幾乎沒有褐化，部分還生出芽點，存活率約為100%（圖3-A、圖3-E、圖3-I）。

用0.4%EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長基本正常，與對照沒有明顯區(qū)別，存活率接近100%（圖3-B）;用0.4% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織輕微褐化，生長受到一定抑制，存活率約為62.5%（圖3-F）;用0.4% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織褐化較深，生長受到明顯抑制，存活率為30%左右（圖3-J）。用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長受到一定抑制，褐化比較明顯，存活率約為98%（圖3-C）;用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織生長受到的抑制程度較大，葉柄、愈傷組織褐化程度較深，愈傷組織存活率為50%左右（圖3-G）;用0.6% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織生長幾乎完全受到抑制，葉柄完全褐化，存活率不到3%（圖3-K）。用0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織2 h時，愈傷組織生長受到明顯抑制，葉柄、愈傷組織褐化程度較深，愈傷組織的存活率接近52%（圖3-D）;0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織4 h時，愈傷組織生長受到嚴(yán)重抑制，愈傷組織褐化嚴(yán)重（圖3-H）;0.8% EMS誘變劑處理愈傷組織6 h時，愈傷組織生長完全抑制，葉柄變黑，愈傷組織完全褐化，存活率為0（圖3-L）。

2.6 EMS半致死劑量的確定

由圖4-D可以看出，用EMS處理2 h時，0.4%、0.6% EMS處理組的愈傷組織致死率與對照相比沒有明顯區(qū)別，然而當(dāng)EMS濃度提高到0.8%時，愈傷組織致死率接近50%;當(dāng)EMS處理時間為4 h時，0.4%、0.6%、0.8% EMS處理愈傷組織的致死率分別為38%、50%、80%，與對照存在顯著性差異;當(dāng)EMS處理時間為6 h時，0.4% EMS處理愈傷組織的致死率已經(jīng)超過70%，0.6% EMS處理愈傷組織的致死率達(dá)到97%，0.8% EMS處理的愈傷組織完全褐化，無法正常生長，致死率為100%。上述統(tǒng)計結(jié)果表明，0.8% EMS處理2 h或0.6% EMS處理4 h時，愈傷組織致死率約為50%。由此可見，0.8% EMS處理2 h、0.6% EMS處理4 h這2種組合可作為半致死條件，用于綠蘿愈傷組織的EMS誘變處理。

3 結(jié)論與討論

3.1 綠蘿的離體快繁

本研究以綠蘿葉柄為外植體，當(dāng)在MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L TDZ、0.3 mg/L NAA時，愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率接近100%。張盛圣研究發(fā)現(xiàn)，以莖段為外植體時，綠蘿愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2，4-D[12]。葉柄和莖段愈傷組織誘導(dǎo)之間存在一定的差異，表明外植體的選擇和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類都會對綠蘿愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對外植體不定芽的誘導(dǎo)具有重要的調(diào)節(jié)作用。試驗結(jié)果表明，葉柄產(chǎn)生的愈傷組織在 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA中的分化率接近100%，其芽分化明顯，數(shù)量較多，生長旺盛。這和張瑜等的研究結(jié)果有所不同，張瑜等以帶節(jié)莖段為外植體進(jìn)行試驗發(fā)現(xiàn)，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA[7]，這很可能是由外植體類型和誘導(dǎo)方式不同所造成的。崔小麗等經(jīng)研究證實，綠蘿生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA[13]。而本研究結(jié)果表明，在1/2MS+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基中，綠蘿不定芽的生根率達(dá)到98%，生根系數(shù)較高，根數(shù)量較多。由此可見，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度對不定芽生根的影響明顯。本研究建立了綠蘿高頻離體再生體系，將為其工廠化繁殖種苗奠定基礎(chǔ)，也為誘導(dǎo)綠蘿突變體等研究提供了條件。

3.2 綠蘿的EMS誘變

將植物組織培養(yǎng)與誘變技術(shù)相結(jié)合的離體誘變技術(shù)，在選育性狀優(yōu)良突變體的過程中，逐漸受到人們的關(guān)注[14]。EMS是目前應(yīng)用較多且最為有效的一種化學(xué)誘變劑[15-16]。目前，尚無關(guān)于綠蘿誘變育種的相關(guān)報道。通過EMS誘變劑處理綠蘿愈傷組織，有助于擴大綠蘿變異譜，豐富種質(zhì)資源，培育出觀賞價值更高和污染清除效果更好的綠蘿新品系。在綠蘿愈傷組織EMS誘變過程中，當(dāng)誘變時間相同時，隨著EMS濃度的增加，葉柄褐化程度逐漸加深，愈傷組織生長所受的抑制程度逐漸加深，存活率逐漸降低。當(dāng)EMS濃度相同時，誘變處理時間越長，愈傷組織褐化程度越深，受到的抑制程度越重，存活率越低。上述結(jié)果表明，綠蘿愈傷組織對于EMS處理表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)。通過分析綠蘿愈傷組織的存活情況可知，0.8% EMS處理2 h或0.6% EMS處理4 h時，綠蘿愈傷組織致死率接近50%，因此這2種組合可作為EMS誘變綠蘿愈傷組織的半致死條件，用于綠蘿愈傷組織的EMS誘變處理。以上研究結(jié)果對于篩選性狀優(yōu)良的綠蘿突變體具有重要的意義。

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